利用ssr指纹图谱鉴别黄魁茶树品种的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及分子生物学领域，具体地说，涉及一种利用SSR指纹图谱鉴别黄魁茶树 品种的方法。
【背景技术】
[0002] 黄化茶是由老茶树或老茶树上的部分茶枝受到外界环境因素的影响发生自然变 异由原来的绿色变为黄色。这一黄化过程的机理比较复杂，外界环境不同，其黄化程度也不 同。黄魁属于黄化茶之一，其特点是干茶嫩黄荷香、茶汤杏黄醇厚、叶底金黄富贵，茶氨酸和 叶黄素含量高。黄魁茶树原种来源于安徽省郎溪县毕桥镇地方茶树群体中的自然变异单 株，通过单株选育出具有优良性状的茶树黄化新品种一一"黄魁"。"黄魁"茶树树姿呈半开 状，芽叶呈金黄色，茸毛较少，发芽率高，每年的亩产量约120斤，黄魁品种适应性强，适合生 长在地山丘陵地带。
[0003] 近几年随着我国黄化茶新品种不断增多，市场上不同品种的黄化茶仅凭肉眼从外 观形态上很难区分，随着国家对植物新品种保护制度的不断完善，急需开发有效的技术措 施对黄魁新品种进行精准鉴定。本发明利用SSR指纹图谱技术对黄魁茶树品种进行鉴定，从 DNA水平上给予黄魁茶独特的指纹身份，有效防止其他品种冒充黄魁茶，从而达到保护黄魁 优良品种的目的。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的是提供一种利用SSR指纹图谱鉴别黄魁茶树品种的方法。
[0005] 本发明利用SSR指纹图谱技术鉴别黄魁品种，其中涉及茶树基因组中一个特异的 微卫星SSR标记，该标记的重复单元是由二碱基组成，其变异程度在茶树基因组中最高，特 异SSR标记的核苷酸序列为 :5/-CTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCT-3/(SEQIDNo: 1)〇
[0006] 上述SSR标记的左、右侧翼保守序列分别如SEQ ID N〇:2和3所示。
[0007] 基于SSR引物设计原则，根据上述SSR标记的侧翼序列设计引物，引物序列为：
[0008] 上游引物：5/-AGGCTAAAGAAGATGGAG-3/，Tm :53·8°C(SEQIDNo:4)
[0009] 下游引物：5/-GAGGGAATGGGTTGTCTA-3/，Tm :53·8。C(SEQIDNo:5)
[0010] SSR引物的筛选步骤如下：以四份省级茶树优良品种黄魁、黄金芽、黄金茶2号和天 台黄茶作为样本材料，茶树样品总DNA的提取，根据茶树全基因组序列进行SSR位点的选择 和引物的设计筛选，通过PCR扩增和琼脂糖凝胶电泳初筛，然后采用Fragment Analyzer ? 全自动毛细管电泳系统复筛，根据电泳结果筛选出核心引物。
[0011]本发明中茶树总DNA提取是采用改良的CTAB法从干茶或茶树叶片中提取基因组 DNA。对茶树全基因组序列进行SSR标记的选择和引物设计筛选，在获得10万个含SSR位点的 序列中，二碱基是茶树基因组中较丰富的微卫星类型，出现最多的碱基重复单元是AT、CT， 从中选取2923条含有SSR位点的序列，成功设计了 415对引物，其中SSR引物筛选的原则如 下：
[0012] ①引物的长度为18-23bp，目的片段在250bp左右。
[0013] ②GC含量为45%-55%，引物序列中避免出现3或4个连续碱基。
[0014]③退火温度在45°C-55°C，最好在50°C左右，上、下游引物Tm值相差不大于4°C。
[0015] ④引物3'端避免出现A或出现3个以上连续碱基，尽量避免引物二聚体和发夹结 构。
[0016] 所述的PCR扩增和琼脂糖凝胶电泳初筛，具体是将PCR产物通过2%琼脂糖凝胶电 泳，选取扩增率大于等于75%、条带单一的PCR产物进行测序，通过与目的片段比对进行引 物的初筛。并通过Fragment Analyzer ?全自动毛细管电泳系统进行复筛，能够精确地反映 等位位点间的差异，筛选出多态性高的引物，最终确定一对核心引物（SEQ ID No: 4和5)用 于黄魁品种的鉴定。
[0017] 本发明还提供一种利用SSR指纹图谱鉴别黄魁茶树品种的方法，包括如下步骤：
[0018] 1)提取待测植株的基因组DNA;
[0019] 2)以待测植株的基因组DNA为模板，利用所述核心引物，进行PCR扩增反应；
[0020] 3)检测PCR扩增产物，如果能够扩增出214bp和236bp大小的特征条带，则待测植株 为黄魁茶树品种。
[0021] PCR扩增体系：50ng/yL基因组DNA2yL，ΙΟμΜ上、下游引物各0.5yL，10 X EasyTaq酶 缓冲液2yL，EasyTaq DNA聚合酶lU，2.5mM dNTP 2yL，ddH20加至总量20yL。
[0022] PCR 程序：94 °C 预变性 5min; 94 °C 变性 30s，55 °C 退火 30s，72 °C 延伸 30s，共 30 个循 环;72°C延伸10min，4°C保存。
[0023] 步骤3)中采用聚丙烯酰胺凝胶电泳检测PCR扩增产物，然后银染显色;或者通过毛 细管电泳检测PCR扩增产物。
[0024] 优选用Fragment Analyzer ?全自动毛细管电泳系统检测PCR扩增产物，由于 Fragment Analyzer ?全自动毛细管电泳系统最低分辨为2bp，因此利用所述核心引物对待 测植株扩增出的两条带分别是214 ± 3bp、236 ± 3bp，均可判定为黄魁品种。
[0025]本发明进一步提供用于筛选或鉴别黄魁茶树品种的PCR检测试剂盒，所述检测试 剂盒包含如SEQ ID No:4和5所示的核心引物。
[0026]本发明具有以下优点：
[0027](一)本发明基于茶树基因组开发出SSR引物，与EST-SSR相比，具有多态性高、数量 多的特点。通过大量的引物筛选，最终确定一对核心引物用于对黄魁品种的鉴定。
[0028] (二)本发明采用SSR指纹图谱技术，该技术具有稳定性好、操作简单，准确率高的 特点，对黄魁优良品种鉴定提供一种精确、快速、简单的方法。
[0029] (三)本发明所选用的材料不受季节、环境和测试时间的限制，可以对黄魁品种生 长任何时期内的任意器官，或制作好储存一段时间的干茶进行DNA提取，均不会影响鉴定结 果。
[0030](四）本发明进行引物筛选优选用Fragment Analyzer ?全自动毛细管电泳系统， 该系统具有高通量、安全方便、灵敏度高等特点，对构建一套快速、精确的SSR指纹图谱技术 起到重要作用，并缩短了黄魁优良品种鉴定的周期。
【附图说明】
[0031]图1为本发明实施例1中干茶或鲜叶总DNA提取的琼脂糖凝胶电泳检测结果。
[0032]图2为本发明实施例3中利用核心SSR引物对四个茶树品种进行PCR检测的琼脂糖 凝胶电泳结果。
[0033]图3为本发明实施例3中四个茶树品种的SSR指纹图谱。
[0034]图4为本发明实施例3中核心SSR引物的PCR产物测序结果与目的片段比对图，旨在 验证引物的真实性，即扩增产物序列中是否包含SSR位点。
【具体实施方式】
[0035]以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例 均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册（Sambrook J&Russell DW, Molecular Cloning:a Laboratory Manual ,2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。
[0036] 以下实施例中引物序列由上海生工合成，PCR扩增产物测序工作由上海生工完成。 PCR反应试剂购自Transgeng公司。
[0037] 以下实施例中使用的CTAB提取液配方如下：20mM EDTA，100mM Tris-HCl，0.075v/ ν%〇β-巯基乙醇，1 .OmM NaCl，4w/v%PVPP-40，CTAB/SDS 2w/v% (十六烷基三甲基溴化铵和 十二烷基硫酸钠质量比1:6)。
[0038] 实施例1干茶或鲜叶总DNA的提取
[0039] 实验对象:茶树品种黄魁、黄金芽、黄金茶2号、天台黄茶。黄魁干茶和鲜叶由安徽 宏云制茶有限公司提供，黄金芽和天台黄茶由安徽农业大学郭河现代农业示范区产学研基 地提供，黄金茶2号由湖南茶科所提供。
[0040] 用改良的CTAB法从干茶或鲜叶中提取总DNA，具体操作如下：
[00411①取2ml离心管加磨碎的干茶粉末O.lg，加900mL预热至65°C的CTAB提取液，加 2OmL0-疏基乙醇，65°C水浴20min，每隔10min轻轻上下摇勾几次，然后加10mL RNAase置于 65°C水浴15min，每隔5min上下摇勾几次。
[0042] ②13000r/min，离心10min，取上清液800mL，加400mL Tris平衡酸，加等体积的氯 仿:异戊醇（氯仿和异戊醇体积比为24:1)至2mL，上下颠倒混匀，13000r/min离心10min，取 上清液650mL转移到新的2ml管中，加氯仿：异戊醇650mL，颠倒混勾，13000r/min离心5min， 取上清液500mL置于新的2ml管中。
[0043]③加乙醇(预先放置于_20°C冰箱中，用完及时放入冰箱中）至2ml处，上下颠倒几 次(会有