一种基因检测中东呼吸综合征冠状病毒的试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种基因检测中东呼吸综合征冠状病毒的试剂盒，特别是涉及一种利 用多重实时荧光聚合酶链式反应技术一管反应即可同时检测中东呼吸综合征冠状病毒UPE 和N基因试剂盒的试剂盒。
【背景技术】
[0002] 冠状病毒为一类大型家族病毒，可引起从感冒到严重急性呼吸综合征等一系列疾 病。中东呼吸综合征是一种由新型冠状病毒引起的病毒性呼吸道疾病，该病毒于2012年9月 从一名60岁沙特阿拉伯男子痰液中首次分离到并首次报道。世界疫症情报网将其排在第6 种新型人类冠状病毒列表中。该病毒自2012年初以来，从沙特阿拉伯开始发现感染人类，并 迅速从约旦、卡塔尔、阿联酋、突尼斯等中东地区发现病人，并波及到过中东旅行的欧洲 (法、英、德、意）也有确诊病人，病死率极高，已引起医学界高度重视。2013年5月28日，世界 卫生组织(World Health Organization，WH0)宣布将此型病毒定名为"中东呼吸综合征冠 状病毒(MERS-CoV)"。中东呼吸综合征冠状病毒是一种人畜共患病毒，目前仍不十分清楚人 如何染上这一病毒。据认为人们可能通过与中东受到感染的单峰骆驼直接或间接接触而染 上病毒。在埃及、阿曼、卡塔尔和沙特阿拉伯等一些国家的骆驼身上发现了中东呼吸综合征 冠状病毒株。病毒来源方面的整体情况尚不清楚。从埃及、阿曼、卡塔尔和沙特阿拉伯的骆 驼中已经分离到与人间毒株相匹配的中东呼吸综合征冠状病毒毒株。对山羊、牛、绵羊、水 牛、猪和野生鸟类等其它动物开展了中东呼吸综合征冠状病毒抗体检测，但迄今为止尚没 有在这些动物中有任何发现。这些研究共同支持这样一种假设，就是单峰骆驼可能是人类 的一个感染源。病人作为传染源已有数起报道，可能存在有限的人传人。
[0003] MERS-CoV的实验室检测包括病毒核酸检测、抗原和抗体检测及作为病毒感染诊断 "金标准"的病毒分离鉴定。其中，反转录-聚合酶链反应（1^￥6^6 1'^118(314口1：；[011-Polymerase C-hain Reaction，RT_PCR)因检测病毒核酸具有周期短、易标准化等优势而广 泛应用于MER S的病原学诊断工作。WHO于2012年12月首次推荐MERS-CoV的实验室诊断标准 流程，以指导临床标本的初筛和确认实验。随着人们对该病毒的深入研究和逐步了解，WHO 又分别于2013年9月和2014年9月更新了指南内容。自2012年确认首例人感染MERS-CoV病例 至2015年6月，全球已有MERS病例1185例，因此，建立特异、有效的快速分子诊断方法对早期 发现和防控疫情十分重要。WHO推荐将MERS-CoV包被蛋白（envelope protein，E蛋白）基因 的5"端上游序列(upstream of envelop gene，UPE)作为初筛检测革E标，0Fla/0Flb作为进 一步确诊检测靶标。如果患者双靶标检测阳性，则为确诊病例;如果患者初筛靶标阳性但第 二革巴标检测阴性，贝||需检测其他基因，包括核衣壳蛋白（]111(316003口81(1?1'(^6；[11，1'1蛋白）、 RNA依赖的RNA聚合酶（Rna Dependent Rna Polymerase，RdRp)和刺突蛋白（spike protein，S蛋白）基因，且通过扩增产物测序确定;如果患者临床症状和流行病学史高度符 合但仅初筛阳性，缺少其他基因检测结果，则作为疑似病例。所有确诊或疑似病例均需连续 采集2次以上标本检测，排除假阳性或假阴性。值得注意的是，对于上呼吸道标本检测阴性 而临床及流行病学史高度符合的患者，应积极采集下呼吸道标本送检，降低假阴性。针对E 蛋白基因上游的检测被认为高度敏感，并推荐用于筛查;针对开放阅读框la的检测被认为 具有同样的敏感性;针对开放阅读框lb的检测则不如诊断开放阅读框la的检测敏感。美国 疾控中心已经开发了针对中东呼吸综合征冠状病毒核壳(N)蛋白基因的实时逆转录-聚合 酶链反应检测法，同UPE基因检测具有高度敏感，可以作为E蛋白基因上游检测的补充，用于 筛查和确诊。迄今，这些实时逆转录-聚合酶链反应检测均未出现与其它呼吸道病毒(包括 人冠状病毒)的交叉反应性。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的在于提供一种利用多重实时荧光聚合酶链式反应技术对中东呼吸 综合征冠状病毒UPE和N基因进行检测的试剂盒，利用本试剂盒可以准确检测MERS-CoV。
[0005] 根据GenBank中登录的MERS-CoV的UPE和N基因序列，应用DNAMAN软件进行同源性 分析，并找出各个病毒的保守区。应用Primer Express3.0软件根据每种病毒基因的保守区 基因设计特异性的引物及探针，并通过NCBI的BLAST功能对其特异性进行初步鉴定。2条探 针分别用FAM和HEX标记，以便于在检测中区分。这些引物探针在含有耐热DNA聚合酶，逆转 录酶、高质量脱氧核糖核苷三磷酸(dNTPs)的RT-PCR反应酶系以及含有Mg 2+等成份的RT-PCR 反应液中，通过荧光PCR仪实现体外核酸的循环扩增。
[0006] 本发明所涉及的试剂盒主要包括：1)RT-PCR反应液、引物探针混合液、RT-PCR反应 酶系、DEPC H20,阴性质控品、阳性质控品和2)分隔并集中包装这些试剂瓶或管的包装盒。
[0007] 本发明的一个优选实施方案是引物探针混合液由UPE和N基因特异性的正、反向引 物，特异性的探针组成，其特征在于uro基因特异性的正向和反向引物的序列分别是5'-TTTCCACTGTTTTCGTGCC-3 ' 和5 ' -GACCCATAGTAGCGCAGAG-3 ' ； UPE基因特异性的探针的序列是 5'-CAGTTCCTCTTCACATAATCGCCCCGAG-3'，探针的两端分别结合有荧光发生基团FAM和荧光 淬灭基团BHQ1; N基因特异性的正向和反向引物的序列分别是5 ' -GTGCTGTTTCCTTTGCCGATA-3'和5'-661厶厶6(：(^厶6161厶(^厶厶6-3'；~基因特异性的探针的序列是5'-ACAGTGTTATTTGGTGCAGCTCGTGGTT-3 '，探针的两端分别结合有荧光发生基团HEX和荧光淬灭 基团BHQ1;
[0008] 本发明的另一个优选实施方案是引物探针混合液中引物浓度为0.2~0.5ymol/L， 探针浓度为〇· 1~〇.25ymol/L。
[0009] 本发明的另一个优选实施方案是RT-PCR反应液由Tr i S-HC1 (50mmo 1 /L，pH8.0~ 8.8)、MgCl2(3 ~8mmol/L)、KCl(150 ~350mmol/L)组成。
[0010] 本发明的另一个优选实施方案是RT-PCR反应酶系由热启动Taq酶、逆转录酶、 dNTPs组成。逆转录酶可选择MMLV等常用逆转录酶。热启动Taq酶、逆转录酶、dNTPs均可采用 市售产品，如Qiagen公司的产品，其中每人份RT-PCR反应酶系中热启动Taq酶的用量为5~ 10U，逆转录酶用量为1.5~5U，dNTPs用量为6~12mmol。
[0011] 本发明的另一个优选实施方案是PCR扩增的条件为:50°C 15分钟，94°C 2分钟;94 °C 15秒，58 °C 35秒，40个循环(退火时收集荧光信号）。
[0012] 本发明的一个优选实施方案是试剂盒提供了质控品，分别为阴性质控品和阳性质 控品。阴性质控品为生理盐水，阳性质控品为人工合成的含有UPE和N基因目的基因的体外 转录RNA。试剂盒中进行待检标本检测可同时进行两种质控品的检测，仅当阳性质控品检测 时FAM、HEX通道荧光信号均呈阳性，阴性质控品检测2个通道荧光信号均呈阴性时，待检标 本的检测结果才有效。
[0013] 本发明的试剂盒扩增待检标本由市售的荧光定量PCR仪自动完成，操作简单，耗时 少，且最大限度地减少了污染的发生。准确检测中东呼吸综合征冠状病毒UPE和N基因，可广 泛应用于中东呼吸综合征疾病临床早期诊断、口岸检验检疫、疫情防控及科学研究等多个 领域。
[0014] 本发明与现有技术相比优点为:①对中东呼吸综合征冠状病毒核酸扩增水平进行 检测，可反映出样本中中东呼吸综合征冠状病毒感染的状态，可用于中东呼吸综合征的监 测和防控及临床诊断，有助于中东呼吸综合征冠状病毒的早期诊断和治疗;②分别针对中 东呼吸综合征冠状病毒UPE和N基因特异性序列设计专用引物、探针，保证检测的特异性和 准确性，也具有较高通量，操作简便、相对降低成本的优点；③一份样本同时对中东呼吸综 合征冠状病毒UPE和N基因，检测过程只需1.5h，相比一个样本进行4次检测，大大减少了工 作量，提高了检测效率；相对于已有的核酸杂交法检测技术，检测所需时间缩短了一半以 上;④试剂采用阴阳性质控品作为质控，能够对试剂的质量进行严格的把控;⑤试剂采用 RT-PCR反应液、引物探针混合液、RT-PCR反应酶系的大包装设置，适合多种荧光检测设备， 具有适用性更加广泛的特点。
【附图说明】
[0015]图1显示PCR扩增的反应条件。
[0016]图2显示UPE基因标准品的扩增曲线。图中FAM通道的扩增曲线为S型，说明试剂盒 具有很好的线性相关性