一种胎儿染色体文库构建的试剂盒、方法及其应用

文档序号:9859872
一种胎儿染色体文库构建的试剂盒、方法及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及无创产前筛查检测领域,具体涉及一种胎儿染色体文库构建的试剂 盒、方法及其应用。
【背景技术】
[0002] 唐氏综合征,又称21-三体综合征或者先天愚型,是由新生儿染色体异常所引起的 先天性疾病。唐氏综合征的发病概率大约在1/800~1/600,在小儿三体型染色体疾病中占 的比重最高,约为70%~80%,而且该病的发病率会随着产妇生育年龄的增高而上升。产前 诊断筛查对于筛查唐氏综合症是很重要而且很有实用性的一部分,大家所熟知的产前诊断 筛查方法主要是传统的一些筛查方法,如羊膜腔穿刺抽取羊水、绒毛膜取样以及穿刺抽取 脐带血等方法。这些方法带有一定的创伤性,对孕妇和胎儿也会造成一定的危险,严重者甚 至可能会带来流产的风险。而且,穿刺抽取羊水要在孕妇孕周达到16周以后才能进行,因为 孕周16周后胎儿才能达到一定的成熟度,易于检测。如果此时诊断结果显示胎儿染色体异 常,则已经错过了最佳的流产时期,可能需要通过引产来解决,这大大增加了孕妇的痛苦且 增加了并发症发生的可能。
[0003] 上世纪九十年代,有研究报道了孕妇的血液循环中有胎儿游离DNA(cff-DNA)的存 在,后来有研究也报道发现孕妇血浆中存在胎儿核糖核酸(RNA),这些重大的临床研究发现 为无创性产前筛查胎儿染色体异常提供了新的可能性。近年来无创性产前筛查诊断取得了 巨大的突破和进展,胎儿游离细胞已经成功地应用于非侵入性产前诊断胎儿性别和Rh血型 鉴定,这些重大的研究和成果都是建立在对母体血浆中cff-DNA序列测定的基础上实现的。 但是在孕妇血浆中,母源性游离DNA含量占整个游离DNA的绝大部分,cff-DNA只占孕妇血浆 中游离DNA总量的3 %~5 %,所以传统的DNA提取技术及PCR等方法难以对胎儿唐氏综合征 进行准确的判断。
[0004] 因此,高效、准确的检测判断胎儿染色体是否为非整倍体就显得极为重要,同时也 成为了无创产前筛查技术的关键。
[0005] CN 104195241 A公开了一种由尿液DNA无创伤性检测胎儿染色体非整倍的方法。 本发明通过孕妇尿液中游离DNA提取结合高通量测序及生物信息分析,可以检测胎儿染色 体是否非整倍,从而辨别胎儿是否患唐氏综合症。该方法DNA提取与DNA高通量测序数据库 构建为两个独立的过程,且步骤繁琐,漂洗复杂,容易影响检测结果。
[0006] 目前的无创产前筛查诊断过程中,游离DNA的提取一般是单独采用市售游离DNA提 取试剂盒进行提取,与文库构建是作为两个独立的环节进行的,整个筛查诊断过程中所需 涉及的试剂盒繁多,操作步骤复杂,容易造成DNA样本的损失或污染,从而影响高通量测序 结果。同时游离DNA的文库构建过程中纯化不彻底,容易留下接头自连的问题,污染测序文 库,也会影响检测结果。

【发明内容】

[0007] 针对现有技术的不足,本发明的目的是提供一种胎儿染色体文库构建的试剂盒、 方法及其应用,所述试剂盒能够快速有效的构建胎儿染色体文库,为无创检测胎儿染色体 是否为非整倍体奠定了基础。
[0008] 为达此目的,本发明采用以下技术方案:
[0009] 第一方面,本发明提供了一种胎儿染色体文库构建的试剂盒,其特征在于,所述试 剂盒包括:用于DNA提取的试剂和用于DNA文库构建的试剂。
[0010] 本发明中,游离DNA的提取和文库的构建只需通过一个试剂盒便可完成,可以系统 的实现样本DNA的提取和文库构建,操作步骤简单,不会造成DNA样本的损失或污染。
[0011]作为优选技术方案,所述用于DNA提取的试剂包括:游离DNA提取试剂、游离DNA沉 淀试剂、游离DNA漂洗试剂。
[0012]优选地,所述用于DNA文库构建的试剂包括:DNA末端修复试剂、连接修复DNA的接 头试剂、PCR扩增引物和纯化文库的试剂。
[0013]优选地,所述试剂盒还包括用于收集提取DNA的离心柱、用于洗脱DNA与文库的超 纯水和磁珠悬浮液。
[0014] 优选地,所述游离DNA提取试剂包括:0.02-0.2M Tri S-HC1缓冲液、100-500yg/mL 蛋白酶K、0·01-0· 1M EDTA和0·05-0·3%Triton-100;
[0015] 所述 Tris-HCl缓冲液的浓度例如可以是 0·02Μ、0·03Μ、0·04Μ、0·05Μ、0·08Μ、0·1Μ、 0.12M、0.15M、0.18M、0.19MS0.2M;
[0016] 所述蛋白酶K 的浓度例如可以是 100yg/mL、101yg/mL、102yg/mL、105yg/mL、108yg/ mL、11Oyg/mL、120yg/mL、150yg/mL、180yg/mL、200yg/mL、250yg/mL、300yg/mL、350yg/mL、 400yg/mL、450yg/mL、480yg/mL或 500yg/mL;
[0017] 所述 EDTA 的浓度例如可以是 0·01Μ、0·02Μ、0·03Μ、0·04Μ、0·05Μ、0·06Μ、0·07Μ、 0.08M^0.09MgSc0.1M;
[0018] 所述!>^〇11-100的浓度例如可以是0.05%、0.06%、0.07%、0.08%、0.1%、 0·12%、0·15%、0·18%、0·2%、0·23%、0·25%、0·28% 或0.3%。
[0019] 优选地,所述游离DNA沉淀试剂为有机溶剂,优选为甲醇、无水乙醇或异丙醇中的 任意一种或至少两种的混合。
[0020] 优选地,所述游离DNA漂洗试剂包括:0.02-0.2M Tris-HCl缓冲液、2-10M异硫氰酸 胍和0.4-3M NaCl;
[0021] 所述 Tris-HCl缓冲液的浓度例如可以是 0·02Μ、0·03Μ、0·04Μ、0·05Μ、0·08Μ、0·1Μ、 0.12M、0.15M、0.18M、0.19MS0.2M;
[0022] 所述异硫氰酸胍的浓度例如可以是2M、2.1M、2.2M、2.5M、2.6M、2.8M、3M、3.5M、4M、 4.51、51、5.51、61、6.51、7]?、7.51、81、8.51、91、9.51、9.81或101 ;
[0023] 所述 NaCl 的浓度例如可以是 0·4Μ、0·5Μ、0·6Μ、0·7Μ、0·8Μ、0·9Μ、1Μ、1·1Μ、1·2Μ、 1.3M、1.5M、1.6M、1.8M、2M、2.1M、2.2M、2.3M、2.5M、2.6M、2.8M、2.9MS3M。
[0024] 优选地,所述DNA末端修复试剂包括:0.02-0.2M Tri s-HCl缓冲液、0.05-0.2U/yL Taq DNA聚合酶、10-100mM MgCh和50-200mM KC1;
[0025] 所述 Tris-HCl缓冲液的浓度例如可以是 0·02Μ、0·03Μ、0·04Μ、0·05Μ、0·08Μ、0·1Μ、 0.12M、0.15M、0.18M、0.19MS0.2M;
[0026] 所述Taq DNA聚合酶的浓度例如可以是0 · 05U/yL、0 · 06U/yL、0 · 07U/yL、0 · 08U/yL、 0·09U/yL、0·1U/yL、0·1lU/yL、0·12U/yL、0·13U/yL、0·14U/yL、0·15U/yL、0·16U/yL、0·17U/ yL、0·18U/yL、0·19U/yL或0·2U/yL;
[0027] 所述 MgCl2 的浓度例如可以是 10mM、llmM、12mM、13mM、15mM、18mM、20mM、25mM、 3 OmM、3 5mM、4 OmM、4 5mM、5 OmM、5 5mM、6 OmM、6 5mM、7 OmM、7 5mM、8 OmM、8 5mM、9 OmM、9 5mM或10OmM。
[0028] 所述 KC1 的浓度例如可以是 50mM、51mM、53mM、55mM、60mM、70mM、80mM、90mM、100mM、 110mM、120mM、130mM、140mM、150mM、160mM、170mM、180mM、190mM或200mM。
[0029] 优选地,所述连接修复DNA的接头试剂包括:10-100mM Tris-HCl缓冲液、0.01-0.5mM T4DNA连接酶和0. l-ΙμΜ连接接头;
[0030] 所述 Tris-HCl缓冲液的浓度例如可以是 0·02Μ、0·03Μ、0·04Μ、0·05Μ、0·08Μ、0·1Μ、 0.12M、0.15M、0.18M、0.19MS0.2M;
[0031] 所述 T4DNA 连接酶的浓度例如可以是 0.01mM、0.02mM、0.03mM、0.04mM、0.05mM、 0·06mM、0·07mM、0·08mM、0·lmM、0·15mM、0·2mM、0·25mM、0·3mM、0·35mM、0·4mM、0·45mM或 0·5mM;
[0032] 所述连接接头的浓度例如可以是 0.1μΜ、0.2μΜ、0.3μΜ、0.4μΜ、0.5μΜ、0.6μΜ、0.7μ M、0.8yM、0.9yMSlyM。
[0033] 优选地,所述PCR扩增引物为常规的通用引物和index引物;
[0034] index引物为标签引物,不同的DNA样本在连接接头的时候,一头会连接通用引物, 另一头会连接index引物;通用引物的序列是相同的,index引物之间序列是不同的,即每个 DNA样本通过不同的index引物进行区分,方便测序后数据的归类与分析。
[0035] 优选地,所述通用物的核苷酸序列包含如SEQ ID NO. 1所示的片段,所述通用引物 的核苷酸序列如下:
[0036] 57-AAT GAT ACG GCG ACC ACC GAG ATC TAC ACT CTT TCC CTA CAC GAC GCT CTT CCG ATOT-31SEQ ID N0.1)。
[0037] 优选地,所述index引物的核苷酸序列包含如SEQ ID NO.2-13所示的片段,所述 index引物的核苷酸序列如
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