[0139] (3) 12000r/min离心lmin弃废液，加入500yL游离DNA漂洗试剂，12000r/min离心 lmin弃废液，重复该步骤一次；
[0140] (4)取出离心柱，转移至干净的收集管中，打开离心柱管盖，室温晾干5min;
[0141] (5)加入40yL超纯水至离心柱中，12000r/min离心lmin收集游离DNA;
[0142] 2)将步骤(1)得到的DNA进行PCR构建高通量测序文库：
[0143] (1)取20ng提取的游离DNA，加入9yL DNA末端修复试剂进行末端修复，得到修复后 DNA；
[0144] (2)加入20yL连接修复DNA接头，与修复后DNA进行连接；
[0145] (3)按体积比1:1.1的比例加入磁珠悬浮液，充分混匀3分钟后置于磁力架上，待溶 液澄清后，弃上清液；
[0146] (4)加入28yL的超纯水，放置磁力架上，溶液澄清后，取上清液转移至干净的EP管 中；
[0147] (5)加入35yL PCR扩增引物，进行PCR扩增，按体积比1:1的比例加入磁珠悬浮液纯 化，得到最终的高通量测序文库。
[0148] 通过Qubit荧光计以及高灵敏Agilent 2100芯片生物分析仪分别对测序文库进行 定量和片段大小分析，结果如图1所示，Qubit定量结果显示游离DNA构建的文库浓度为 10.33]^/4^，文库总量为309.9即。
[0149] 取lyL文库稀释10倍后，通过高灵敏Agilent 2100芯片生物分析仪对其片段大小 进行检测，结果见图2。从图2可以看出，游离DNA构建的文库片段大小检测峰值为322bp和 488bp，其中322bp附近的片段是由片段205bp附近的游离DNA与接头连接后形成的;488bp附 近的片段是由较大的游离DNA片段与接头连接形成，该游离DNA片段由于浓度较低，在游离 DNA片段2100检测中未出现峰值，当连接了接头后，由于进行了PCR扩增，浓度增高，因此在 文库检测中会出现峰值，与相关报道一致。
[0150] 实施例3文库质检
[0151] 通过实时荧光定量PCR进一步检测文库是否存在接头自连污染，从文库中取出UiL 溶液，使用ΚΑΡΑ BIOSYSTEMS公司的高通量测序文库定量试剂盒，按照说明书操作步骤对文 库进行检测。检测结果见图3和图4。图3显示文库扩增曲线重复性非常好，3次重复检测的Ct 值分别为11.98、11.94和11.95，表明文库构建成功，qPCR操作未造成污染。图4是文库的熔 解曲线图，从图4可以看出文库熔解曲线中只有单一的峰，没有杂峰，表明采用本发明涉及 的试剂盒和方法构建的文库没有出现接头自连的现象，文库纯度非常高，适合用于高通量 测序平台测序。
[0152] 申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局 限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的 技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的 添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
【主权项】
1. 一种胎儿染色体文库构建的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：用于DNA提取的 试剂和用于DNA文库构建的试剂。2. 根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述用于DNA提取的试剂包括:游离DNA 提取试剂、游离DNA沉淀试剂、游离DNA漂洗试剂； 优选地，所述用于DNA文库构建的试剂包括:DNA末端修复试剂、连接修复DNA的接头试 剂、PCR扩增引物和纯化文库的试剂； 优选地，所述试剂盒还包括用于收集提取DNA的离心柱、用于洗脱DNA与文库的超纯水 和磁珠悬浮液。3. 根据权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于，所述游离DNA提取试剂包括:0.02-0·2M Tris-HCl缓冲液、100-500yg/mL蛋白酶K、0·01-0· 1M EDTA和0·05-0·3%Triton-100; 优选地，所述游离DNA沉淀试剂为有机溶剂，优选为甲醇、无水乙醇或异丙醇中的任意 一种或至少两种的混合； 优选地，所述游离DNA漂洗试剂包括:0.02-0.2M Tris-HCl缓冲液、2-10M异硫氰酸胍和 0.4-3M NaCl〇4. 根据权利要求1-3中任一项所述的试剂盒，其特征在于，所述DNA末端修复试剂包括： 0·02-0·2Μ Tris-HCl缓冲液、0.05-0.2U/yL Taq DNA聚合酶、10-100mM MgCl2和50-200mM KC1； 优选地，所述连接修复DNA的接头试剂包括：10-100mM Tris-HCl缓冲液、0.01-0.5mM T4DNA连接酶和0.1-1μΜ连接接头； 优选地，所述PCR扩增引物为常规的通用引物和index引物； 优选地，所述通用物的核苷酸序列包含如SEQ ID NO. 1所示的片段； 优选地，所述index引物的核苷酸序列包含如SEQ ID NO. 1-12所示的片段； 优选地，所述PCR扩增引物的浓度为0.02-0.5mM; 优选地，所述纯化文库的试剂为磁珠悬浮液。5. -种使用如权利要求1-4中任一项所述的试剂盒用于构建胎儿染色体高通量测序文 库的方法，其特征在于，包括如下步骤： 1) 提取待测样本的DNA; 2) 将步骤(1)得到的DNA进行PCR构建高通量测序文库。6. 根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述待测样本为母体外周血、尿液、脑脊 液、血清、唾液或是宫颈灌洗液中的任意一种或至少两种的混合； 优选地，所述待测样本的母体的孕周为12-24周。7. 根据权利要求5或6所述的方法，其特征在于，步骤（1)所述提取待测样本的DNA包括 如下步骤： (1) 取300-500yL待测样品，加入300-600yL，优选400-550yL游离DNA提取试剂，45-65 。(：，优选50-60 °C 水浴保温5-20min，优选8-15min; (2) 加入300-600yL，优选400-550yL游离DNA沉淀试剂，室温孵育l-10min，优选3-8min 后转移至尚七、柱中； (3) 离心弃废液，加入300-600yL，优选400-550yL游离DNA漂洗试剂，离心弃废液，重复 该步骤一次； (4) 取出离心柱，转移至干净的收集管中，打开离心柱管盖，室温晾干1-lOmin，优选3-8min； (5) 加入10-100yL，优选20-50yL超纯水至离心柱中，离心收集游离DNA; 优选地，步骤(3)和步骤(5)所述离心的转速为8000-15000r/min，优选为1000-13000r/ min，进一步优选为 12000r/min; 优选地，步骤(3)和步骤(5)所述离心的时间为2〇-12〇8，优选为3〇-10〇8，进一步优选为 60s〇8. 根据权利要求5或6所述的方法，其特征在于，步骤(2)所述构建高通量测序文库包括 如下步骤： (1) 取5-50ng，优选10-25ng提取的游离DNA，加入1 -30yL，优选5-15yL DNA末端修复试 剂进行末端修复，得到修复后DNA; (2) 加入8-35yL，优选12-25yL连接修复DNA接头，与修复后DNA进行连接； (3) 按体积比1: (0.3-5)，优选1: (0.8-3)的比例加入磁珠悬浮液，充分混匀l-10min，优 选2-6min后置于磁力架上，待溶液澄清后，弃上清液； (4) 加入10-50yL，优选15-40yL的超纯水，放置磁力架上，溶液澄清后，取上清液转移至 干净的EP管中； (5) 加入15-60yL，优选25-45yL PCR扩增引物，进行PCR扩增，按体积比1: (0.3-5)，优选 1: (0.8-3)的比例加入磁珠悬浮液纯化，得到最终的高通量测序文库。9. 根据权利要求5或6所述的方法，其特征在于，包括如下步骤： 1) 提取待测样本的DNA: (1) 取300-500yL待测样品，加入500yL游离DNA提取试剂，56°C水浴保温lOmin; (2) 加入500yL游离DNA沉淀试剂，室温孵育5min后转移至离心柱中； (3) 12000r/min离心lmin弃废液，加入500yL游离DNA漂洗试剂，12000r/min离心lmin弃 废液，重复该步骤一次； (4) 取出离心柱，转移至干净的收集管中，打开离心柱管盖，室温晾干5min; (5) 加入40yL超纯水至离心柱中，12000r/min离心lmin收集游离DNA; 2) 将步骤(1)得到的DNA进行PCR构建高通量测序文库： (1) 取20ng提取的游离DNA，加入9yL DNA末端修复试剂进行末端修复，得到修复后DNA; (2) 加入20yL连接修复DNA接头，与修复后DNA进行连接； (3) 按体积比1:1.1的比例加入磁珠悬浮液，充分混匀3分钟后置于磁力架上，待溶液澄 清后，弃上清液； (4) 加入28yL的超纯水，放置磁力架上，溶液澄清后，取上清液转移至干净的EP管中； (5) 加入35yL PCR扩增引物，进行PCR扩增，按体积比1:1的比例加入磁珠悬浮液纯化， 得到最终的高通量测序文库。10. -种如权利要求1-4中任一项所述的试剂盒、或权利要求5-9中任一项所述的方法 用于检测胎儿染色体是否为非整倍体的应用。
【专利摘要】本发明涉及无创产前筛查检测领域，具体涉及一种胎儿染色体文库构建的试剂盒、方法及其应用，所述试剂盒包括：用于DNA提取的试剂和用于DNA文库构建的试剂。本发明制备的胎儿染色体文库构建的试剂盒，相比于目前国内外市场上的其他游离DNA文库构建试剂盒，能直接对孕妇血浆进行游离DNA提取，进行测序文库构建，可以完整系统性的实现样本游离DNA的提取和文库构建，可用于高通量无创筛查胎儿染色体是否为非整倍体，操作方便、简单、快速，检测结果高效、准确，灵敏度高，具有重要价值。
【IPC分类】C40B50/06, C12Q1/68
【公开号】CN105624798
【申请号】CN201610094500
【发明人】陈勇, 张梦玲, 谢文龙, 王玲
【申请人】北京乐普基因科技股份有限公司
【公开日】2016年6月1日
【申请日】2016年2月19日