多能干细胞的培养方法、该方法中所使用的多能干细胞的培养用试剂盒及培养基的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种多能干细胞的培养方法、该方法中所使用的多能干细胞的培养用 试剂盒及培养基。
【背景技术】
[0002] 以损伤组织的功能恢复等为目的开发了各种再生医疗。其中，报告了大量关于以 组织本身的再生等为最终目的的灵长类尤其人类的全能或多能干细胞的技术。尤其，诱导 型多能干细胞（iPS细胞)与胚胎干细胞不同是从体细胞诱导，因此具有伦理方面的问题少 的优点。
[0003] 在培养这些灵长类的全能或多能干细胞(对这两者进行统称，本发明中简称为"多 能干细胞"。）的情况下，要求在未分化状态下经长期维持。为了长期培养未分化状态的多能 干细胞，通常使用小鼠成纤维细胞等饲养细胞。
[0004] 然而，指出因使用如所述小鼠成纤维细胞的来源于异种动物的饲养细胞，培养液 中可能混入来源于异种动物的抗原性物质等的异物。因此，在将全能或多能干细胞用于医 疗用途或与此相当的用途的情况下，要求将这些细胞在不存在饲养细胞的条件下进行培 养。
[0005] 鉴于这种情况，进行了代替饲养细胞功能的细胞粘附性材料的开发。例如Nature Biotechnology ,2001，Vol 19，pp .971-974中公开了作为饲养细胞的代替物使用小鼠肉瘤 提取成分即基质胶，始终良好地对维持了未分化状态的人胚胎干细胞进行培养。
[0006] 日本专利公开2001-17183号公报中公开有不含饲养细胞且含有增殖的灵长类原 始细胞的细胞性组合物，作为优选方式公开有还含有细胞外基质的细胞性组合物。并且，日 本专利公开2010-29186号公报中公开有以含有规定浓度的细胞外基质蛋白质及水性溶剂 的涂布溶液，进一步涂布已进行等离子体聚合的细胞培养表面的细胞培养基质，并且记载 有根据该细胞培养基质具有有助于避免胚胎干细胞的分化的良好的粘附性。
[0007] Biomaterials，2010，Nov;Vol.31(32)，ρρ·8281_8288及Nature biotec hnology, 2010，Vol. 28，No.6，pp.606-610中分别公开有由可有助于胚胎干细胞的长期培养的玻连蛋 白部分序列构成的重组肽或合成肽，具体而言，天然玻连蛋白的第1个~第52个氨基酸序列 (参考Biomaterials,2010，Nov;Vol.31(32)，ρρ·8281-8288)及包含RGD序列的第41 个~第 52个氛基酸序列（参考Nature biotechnology，2010，Vol · 28，Νο · 6，ρρ · 606-610)。已知由于 这些肽为非生物体试料，因此能够避免混入抗原性物质等的可能性，且可进行工业生产这 一点上优异。
[0008] 并且，对于在未分化状态下培养多能干细胞的培养基，例如，日本专利公表2013-510567号公报中公开有包含抗坏血酸、碱性成纤维细胞生长因子(bF GF)的无血清及不含 异种成分的培养基。
[0009] 发明的概要
[0010]发明要解决的技术课题
[0011] 虽然发现如日本专利公开2001-17183号公报、日本专利公开2010-29186号公报、 Nature Biotechnology,2001,Vo119,pp.971-974nBiomaterials,2010,Nov；Vo1.31(32), pp · 8281-8288及Nature biotechnology, 2010 ,Vol · 28 ,No · 6 ,pp · 606-610中所公开的可代 替饲养细胞的材料，或如日本专利公表2013-510567号公报中所公开的适合于多能干细胞 培养的培养基，但要求具有更优异的多能干细胞的细胞培养性能的培养方法。
[0012] 因此本发明的目的在于提供一种多能干细胞的细胞培养性能尤其细胞增殖能力 优异的多能干细胞的培养方法、该方法中所使用的多能干细胞的培养用试剂盒及培养基。
[0013] 用于解决技术课题的手段
[0014] 本发明人等为了解决所述课题，对多能干细胞的培养方法，不断进行深入研究的 结果，发现通过使用包含人玻连蛋白或人玻连蛋白的规定的部分氨基酸序列的多肽与包含 规定量的抗坏血酸衍生物的培养基培养多能干细胞，多能干细胞的细胞培养性能尤其细胞 增殖能力优异，由此完成了本发明。
[0015] 即，本发明的多能干细胞的培养方法包含：
[0016] 在支撑体的细胞培养表面赋予(a)具有由序列号1表示的氨基酸序列的多肽，
[0017] (b)具有与由序列号1表示的氨基酸序列的同源性为80%以上的氨基酸序列且具 有多能干细胞的培养性能的多肽、或
[0018] (c)具有序列号1中缺失、取代或附加1或数个(优选1~5个)氨基酸的氨基酸序列 且具有多能干细胞的培养性能的多肽，
[0019] 以获得多肽包覆培养表面的阶段;及
[0020] 在所述多肽包覆培养表面上接种多能干细胞并使用抗坏血酸衍生物的含量为 1.5mmol/L(mM)以上的培养基进行培养的阶段。
[0021] 并且，本发明的其他多能干细胞的培养方法包含：
[0022] 在支撑体的细胞培养表面赋予下述(d)的多肽，以获得多肽包覆培养表面的阶段， (d)包含：
[0023] (1)包含选自由CSYYQSC(序列号2)表示的氨基酸序列及由RGD表示的氨基酸序列 中的至少一个的第1区域、及
[0024] (2)包含（2-i)由 PRPSLAKKQRFRHRNRKGYRSQRGHSRGRNQN(序列号 3)表示的氨基酸序 列、（2-ii)与由序列号3表示的氨基酸序列具有80%以上的同源性且具有对支撑体的细胞 培养表面的吸附能力的氨基酸序列、或(2-iii)相对由序列号3表示的氨基酸序列缺失、取 代或附加1或数个(优选1~5个)氨基酸残基且具有对支撑体的细胞培养表面的吸附能力的 氨基酸序列的第2区域，
[0025] 且由40个~450个氨基酸残基构成;及
[0026] 在所述多肽包覆培养表面上接种多能干细胞并使用抗坏血酸衍生物的含量为 1.5mmol/L(mM)以上的培养基进行培养的阶段。
[0027] 本发明的多能干细胞的培养用试剂盒，其由
[0028] (a)具有由序列号1表示的氨基酸序列的多肽、
[0029] (b)具有与由序列号1表示的氨基酸序列的同源性为80%以上的氨基酸序列且具 有多能干细胞的培养性能的多肽、或
[0030] (c)具有序列号1中缺失、取代或附加 1或数个(优选1~5个)氨基酸的氨基酸序列 且具有多能干细胞的培养性能的多肽、及
[0031] 抗坏血酸衍生物的含量为1.5mm〇l/L(mM)以上的培养基构成。
[0032] 并且，本发明的其他的多能干细胞的培养用试剂盒，其由
[0033]下述（d)的多肽及抗坏血酸衍生物的含量为1.5mmol/L(mM)以上的培养基构成， (d)包含：
[0034] (1)包含选自由CSYYQSC(序列号2)表示的氨基酸序列及由RGD表示的氨基酸序列 中的至少一个的第1区域、及
[0035] (2)包含（2-i)由 PRPSLAKKQRFRHRNRKGYRSQRGHSRGRNQN (序列号 3)表示的氨基酸序 列、（2-ii)与由序列号3表示的氨基酸序列具有80%以上的同源性且具有对支撑体的细胞 培养表面的吸附能力的氨基酸序列、或(2-iii)相对由序列号3表示的氨基酸序列缺失、取 代或附加1或数个(优选1~5个)氨基酸残基且具有对支撑体的细胞培养表面的吸附能力的 氨基酸序列的第2区域，
[0036] 且由40个~450个氨基酸残基构成。
[0037]本发明的培养基为抗坏血酸衍生物的含量为1.5mm〇l/L(mM)以上的培养基。
[0038]发明效果
[0039]根据本发明，能够提供一种多能干细胞的细胞培养性能尤其细胞增殖能力优异的 多能干细胞的培养方法、该方法中所使用的多能干细胞的培养用试剂盒及培养基。
【附图说明】
[0040] 图1是表示本发明所涉及的各多肽的培养板表面的吸附试验结果的曲线图。
[0041] 图2是表示使用本发明所涉及的各多肽的iPS细胞的增殖曲线的曲线图。
[0042]图3A是在本发明所涉及的各多肽上进行了培养时的iPS细胞集落的形态图像(左 栏)及放大图像(右栏）。
[0043]图3B是在本发明所涉及的各多肽上进行了培养时的iPS细胞集落的形态图像(左 栏)及放大图像(右栏）。
[0044] 图3C是在本发明所涉及的各多肽上进行了培养时的iPS细胞集落的形态图像(左 栏)及放大图像(右栏）。
[0045] 图3D是在本发明所涉及的各多肽上进行了培养时的iPS细胞集落的形态图像(左 栏)及放大图像(右栏）。
[0046] 图3E是在本发明所涉及的各多肽上进行了培养时的iPS细胞集落的形态图像(左 栏)及放大图像(右栏）。
[0047]图4A是在本发明所涉及的各多肽上进行了培养时的iPS细胞的DAPI染色图像(左 栏)及NAN0G染色图像(右栏）。
[0048]图4B是在本发明所涉及的各多肽上进行了培养时的iPS细胞的DAPI染色图像(左 栏)及NAN0G染色图像(右栏）。
[0049] 图4C是在本发明所涉及的各多肽上进行了培养时的iPS细胞的DAPI染色图像(左 栏)及NAN0G染色图像(右栏）。
[0050] 图4D是在本发明所涉及的各多肽上进行了培养时的iPS细胞的DAPI染色图像(左 栏)及NANOG染色图像(右栏）。
[0051]图4E是在本发明所涉及的各多肽上进行了培养时的iPS细胞的DAPI染色图像(左 栏)及NAN0G染色图像(右栏）。
【具体实施方式】
[0052]以下，对本发明的实施方式进行详细的说明。
[0053] < 多肽 >
[0054] 本发明所涉及的多肽为(a)具有由序列号1表示的氨基酸序列的多肽、
[0055] (b)具有与由序列号1表示的氨基酸序列的同源性为80%以上的氨基酸序列且具 有多能干细胞的培养性能的多肽、或
[0056] (c)具有序列号1中缺失、取代或附加 1或数个氨基酸的氨基酸序列且具有多能干 细胞的培养性能的多肽。
[0057] 序列号1:
[0058] DQESCKGRCTEGFNVDKKCQCDELCSYYQSCCTDYTAECKPQVTRGDVFTMPEDEYTVYDDGEEKNNATVHEQVGGP SLTSDLQAQSKGNPEQTPVLKPEEEAPAPEVGASKPEGIDSRPETLHPGRPQPPAEEELCSGKPFDAFTDLKNGSLF AFRGQYCYELDEKAVRPGYPKLIRDVWGIEGPIDAAFTRINCQGKTYLFKGSQYWRFEDGVLDPDYPRNISDGFDGI PDNVDAALALPAHSYSGRERVYFFKGKQYWEYQFQHQPSQEECEGSSLSAVFEHFAMMQRDSWEDIFELLFWGRTSA GTRQPQFISRDWHGVPGQVDAAMAGRIYISGMAPRPSLAKKQRFRHRNRKGYRSQRGHSRGRNQNSRRPSRATWLSL FSSEESNLGANNYDDYRMDWLVPATCEPIQSVFFFSGDKYYRVNLRTRRVDTVDPPYPRSIAQYWLGCPAPGHL
[0059] 在此，"具有多能干细胞的培养性能"是指具有多能干细胞的增殖活性，可通过如 下进行对于是否具有增殖活性的评价，例如在吸附该多肽的细胞培养表面上接种多能干细 胞使其细胞密度达到250cell S/孔，并培养8天后用PBS清洗方式除去非粘附细胞时，粘附细 胞是否存在2500cellS/孔(接种细胞数的10倍)以上。
[0060] 在此粘附细胞数的定量可通过对多能干细胞所表现的碱性磷酸酶的活性进行定 量的方法或MTT试验等来进行定量。
[0061] 由上述序列号1所表示的全长495氨基酸残基构成的多肽为玻连蛋白，在本发明 中，玻连蛋白是指人玻连蛋白。另外，确认了天然的玻连蛋白为序列的一部分中具有糖链的 糖蛋白质。
[0062]以下，本说明书中，有时将本发明所涉及的多肽称为"培养用多肽"。
[0063]在本说明书中"工序"这一用语，不只是独立的工序，即使无法与其他工序明显地 区别的情况下也能够实现本工序所期望的目的，则也包含在本用语中。
[0064] 并且，在本说明书中用"~"来表示的数值范围表示分别将"~"的前后所记载的数 值作为最小值及最大值来包含的范围。
[0065] 并且，在本说明书中，对于组合物中的各成分的量，在存在多个相当于组合物中各 成分的物质时，若无特别说明，表示组合物中存在的该多个物质的总量。
[0066] 本申请说明书中，"1或数个"表示例如"1个~5个"。
[0067] 在本说明书中，"同种"是指人，"异种"是指除人以外的动物。
[0068] 本说明书中，有时将氨基酸序列中的氨基酸残基以本技术领域中周知的单字母标 记(例如，将甘氨酸残基标记为"G"）或三字母标记(例如，将甘氨酸残基标记为"Gly"）来进 行标记。
[0069]本发明中，对于与多肽的氨基酸序列有关的"％"，若无特别说明，以氨基酸(或亚 氨基酸)残基的个数为基准。
[0070] 在本说明书中，对于氨基酸序列的特定氨基酸残基所使用的"对应的氨基酸残基" 等的表述是指将进行对比的两个以上氨基酸序列，以本技术领域中周知的方法，在插入、缺 失及取代考虑在内的基础上，以相等的氨基酸残基达到最多的方式进行排列(对齐)时，与 成为基准的氨基酸序列中的特定氨基酸残基的位置一致的其他氨基酸序列中的氨基酸残 基。
[0071] 有关本说明书中的氨基酸序列的"同源性"可以是指使用BLAST软件包（参考 Ausubel等，1999Short Protocols in Molecular Biology，4thEd_C hapter 18)计算的 值。例如，相对序列号1的同源性为80%以上是指BLAST中的Max. Identities的值为80以上。
[0072] (b)的多肽优选为具有与由序列号1表示的氨基酸序列的同源性为90%以上（即 90%~100%)的氨基酸序列且具有多能干细胞的培养性能的多肽，更优选为具有与由序列 号1表示的氨基酸序列的同源性为95%以上（即95%~100%)的氨基酸序列且具有多能干 细胞的培养性能的多肽。
[0073]并且，（c)的多肽优选为具有序列号1中缺失、取代或附加1~5个氨基酸的氨基酸 序列且具有多能干细胞的培养性能的多肽。
[0074]本发明所涉及的多肽优选为(al)由序列号1所表示的氨基酸序列构成的多肽、 [0075] (bl)由与序列号1所表示的氨基酸序列的同源性为80%以上（即80%~100%)的 氨基酸序列构成且具有多能干细胞的培养性能的多肽、或
[0076] (cl)由序列号1中缺失、取代或附加 1或数个氨基酸的氨基酸序列构成且具有