一种从竹笋中提取活性化合物的方法及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物技术领域，具体设及一种从竹算中提取活性化合物的方法及在制 备具有酪氨酸酶抑制活性的抑制剂中的应用。
【背景技术】
[0002] 竹算是禾本科多年生植物竹子的嫩茎，自古被称作"菜中珍品"，在我国食用已有 2500多年的历史。竹算鲜嫩，肉质松脆，味道鲜美，含有高蛋白、低淀粉、低脂肪，还含有糖类 及巧、憐、铁、胡萝l·素、Vbi、Vb2、Vc等多种营养物质，其中人体所需的氨基酸含量特别丰富， 长期食用竹算有促进肠道蠕动、帮助消化、预防肠癌和屯、血管疾病之功效。竹算的主要功用 在食用方面，此外，竹算还W提取物的形式在食品、饮品、保健(功能)食品、天然药物、W及 食品添加剂和化妆品添加剂等领域得到广泛应用。
[0003] 酪氨酸酶(Tyrosinase)广泛分布于微生物、动植物W及人体中，是目前己知的生 物体中参与黑色素(Melanin)合成的关键酶，不仅决定黑素合成的速率，还是黑素细胞分化 成熟的特征性标志，与人的衰老、昆虫的伤口愈合与发育、果蔬的褐变等有密切关系。它不 但用于色素增加性皮肤病（白齋风、黄褐斑、雀斑、老年斑等）的临床治疗，而且可用于化妆 品使肤色增白，还有可能应用于农业生产上作为一种害虫调控剂和食品工业上作为食品添 加剂。
[0004] 到目前为止，受限于有效性、安全性W及成本等因素，只有极少数酪氨酸酶抑制剂 被用于商业上。因此，在医药、食品和化妆品领域，目前迫切需要寻找安全和有效的酪氨酸 酶抑制剂。而且，由于近年来人们对"组分天然化"和"回归大自然"的呼声越来越高读全而 无毒副作用的天然植物成为该类产品的发展方向，天然的酪氨酸性抑制剂可能是一种替代 非天然酪氨酸酶活性抑制剂的先导化合物的良好来源。
【发明内容】
[0005] 本发明提供一种从竹算中提取活性化合物的方法，包含W下步骤： (1) 取竹算粉碎，用竹算质量5~10倍的乙醇水溶液回流提取2~3次，每次回流2~3小 时，过滤，合并滤液； (2) 将步骤(1)滤液浓缩至无乙醇后，离屯、分离去沉淀，得溶液； (3) 将步骤(2)溶液用石油酸脱脂，然后依次用乙酸乙醋和正下醇萃取； (4) 将乙酸乙醋萃取部分浓缩成浸膏，用正相硅胶柱分离，采用体积比30: 1~1:1的氯 仿-甲醇系统梯度洗脱； 收集体积比20:1的氯仿-甲醇洗脱液，浓缩后采用硅胶柱层析，石油酸-丙酬溶液洗脱， 洗脱液浓缩，在浓缩过程中有固体小颗粒析出，用丙酬溶解，加入石油酸进行重结晶，得到 化合物对径基苯甲醒，其中石油酸-丙酬溶液为石油酸和丙酬按体积比8:1混合制得； 收集体积比15:1的氯仿-甲醇洗脱液，浓缩后采用正相硅胶柱层析，石油酸-丙酬溶液 梯度洗脱，收集体积比9:1~7:1的石油酸-丙酬洗脱液浓缩制得对径基苯甲酸甲醋粗品，收 集体积比6:1~3:1的石油酸-丙酬洗脱液浓缩制得对径基亚苄基丙酬粗品，将两个粗品分 别经凝胶柱层析，甲醇为洗脱溶剂，分别收集洗脱液浓缩得到对径基苯甲酸甲醋和对径基 亚苄基丙酬； 收集体积比8:1的氯仿-甲醇洗脱液，浓缩后经反相硅胶柱层析，用体积比为30:70~ 60:40的甲醇-水溶液梯度洗脱，将体积比为50:50的洗脱液经正相硅胶柱层析，体积比3:1 的石油酸-丙酬混合液洗脱，洗脱液结晶，得到化合物对径基苯甲酸； 巧)将正下醇萃取部分浓缩成浸膏，水溶解后加入大孔树脂柱吸附，用质量百分比浓度 为40~60%的乙醇溶液洗脱，HPLC跟踪分析，收集含2R- β - D -化喃葡萄糖基-2-对径基苯 乙腊成分的洗脱液，浓缩后拌入硅胶，常规干燥，过正相硅胶柱进行柱层析，W体积比5:1~ 1:1的氯仿-甲醇混合液进行洗脱，得到2R- β - D -化喃葡萄糖基-2-对径基苯乙腊的粗 品，在重结晶溶剂中加热溶解至饱和，置于低溫环境下进行重结晶，得到2R- β - D -化喃 葡萄糖基-2-对径基苯乙腊。
[0006] 可用于本发明的竹子品种原料没有特别限制，可W是不同属的竹子，优选牡竹属 的竹算为主，如龙珠、麻竹、山竹。竹算可W是竹算肉也可W是竹算全株，还可W是竹算的废 弃物如算头和算壳等。
[0007] 所述步骤(1)的乙醇水溶液为质量百分比浓度为50-90%的溶液。
[0008] 所述步骤(4)中反相硅胶柱填料为RP-18或RP-8,凝胶柱填料为径丙基葡聚糖凝胶 Sephadex L肥0。
[0009] 所述步骤巧）中重结晶溶剂为氯仿和甲醇按体积比2:1混合制得的溶液。
[0010]从竹算中提取的具有酪氨酸酶抑制活性的多酪类化合物，包括2R- β- D -邮喃葡 萄糖基-2-对径基苯乙腊（I)、对径基亚苄基丙酬（Π )、对径基苯甲醒（虹）、对径基苯甲酸 (IV)、对径基苯甲酸甲醋（V)，化学结构如下：
本发明另一目的是将上述化合物应用在制备酪氨酸酶抑制剂中；即在制备预防和治疗 黑色素合成异常导致的人体色素沉着性疾病或黑色素瘤药物中的应用。
[0011] 本发明步骤(5)是现有技术的常规大孔吸附树脂上完成的，大孔吸附树脂用乙醇 清洗后还可重复使用，大孔吸附树脂为非极性树脂或弱极性树脂;优选地，树脂为D101大孔 树脂。
[0012] 本发明优点和技术效果:本发明中竹算原料具有生长量大、生长快、原料易得;单 体成分工艺操作简便、重复性好，产品纯度高，适合工业化生产，能够有效预防和治疗黑色 素合成异常导致的人体色素沉着性疾病、黑色素瘤W及其它需要抑制酪氨酸酶活性的病 症，可用于制备治疗此类疾病的药物。
【具体实施方式】
[0013] 下面将结合实施例进一步详细说明本发明的实质内容和有益效果，该实施例仅用 于说明本发明而非对本发明的限制。
[0014] 实施例1:本从竹算中提取活性化合物的方法，具体操作如下： (1) 取18kg竹算样品粉碎，用竹算质量5倍质量百分比浓度80%的乙醇水溶液回流提取3 次，每次回流2小时，过滤，合并滤液； (2) 将步骤(1)滤液浓缩至无乙醇后，离屯、分离去沉淀，得溶液； (3) 将步骤(2)溶液用石油酸脱脂，然后依次用乙酸乙醋和正下醇萃取； (4) 将乙酸乙醋萃取部分浓缩成浸膏，重75g，用80 g硅胶拌样，常规干燥，干法上样，用 正相硅胶柱分离，采用体积比30: 1~1:1的氯仿-甲醇系统梯度洗脱，收集体积比20:1的氯 仿-甲醇洗脱液，浓缩后采用硅胶柱（200~300目硅胶)层析，石油酸-丙酬溶液(体积比8:1) 洗脱，洗脱液浓缩，在浓缩过程中有固体小颗粒析出，用丙酬溶解，加入石油酸进行重结晶， 得到化合物13.6g对径基苯甲醒； 收集体积比15:1的氯仿-甲醇洗脱液，浓缩后采用正相硅胶柱层析(填料200-300目）， 石油酸-丙酬溶液梯度洗脱，收集体积比8:1的石油酸-丙酬洗脱液浓缩制得对径基苯甲酸 甲醋粗品，收集体积比4:1的石油酸-丙酬洗脱液浓缩制得对径基亚苄基丙酬粗品，将两个 粗品分别经凝胶柱层析(凝胶柱填料为径丙基葡聚糖凝胶S邱hadex LH20)，甲醇为洗脱溶 剂，分别收集洗脱液浓缩得到560mg对径基苯甲酸甲醋和720mg对径基亚苄基丙酬； 收集体积比8:1的氯仿-甲醇洗脱液，浓缩后经反相硅胶柱层析(反相硅胶柱填料为RP- C18)，用体积比为30: 70~60:40的甲醇-水溶液梯度洗脱，将体积比为50:50的洗脱液经正 相硅胶柱层析，体积比3:1的石油酸-丙酬混合液洗脱，收集洗脱液得到1.6 g对径基苯甲酸 粗品，结晶，将粗品加热溶解后置于冰箱中，5°C下结晶，得到化合物对径基苯甲酸； 巧)将正下醇萃取部分浓缩成浸膏，水溶解后加入D-101大孔树脂柱吸附，用质量百分 比浓度为50%的乙醇溶液洗脱，HPLC跟踪分析，收集含2R- β - D -化喃葡萄糖基-2-对径基 苯乙腊成分的洗脱液，浓缩后拌入硅胶，常规干燥，过正相硅胶柱进行柱层析，W体积比3:1 的氯仿-甲醇混合液进行洗脱，得到2R- β - D -化喃葡萄糖基-2-对径基苯乙腊的粗品，在 重结晶溶剂(氯仿和甲醇按体积比2:1混合制得的溶液）中加热溶解至饱和，置于低溫环境 下进行重结晶，得到13.Og 2R- β - D -化喃葡萄糖基-2-对径基苯乙腊。
[0015] 上述方法制得的多酪类化合物的核磁共振光谱数据： 2R- β - D -化喃葡萄糖基-2-对径基苯乙腊：
对径基亚苄基丙酬：1化-醒3(〔0(：13，1001化，5):198.2(3，（：-9)，159.0(3，（：- 4) , 145.0 (d, C-7), 130.5 (s, C-1), 126.4 (d, C-2,6), 116.2 (d, C-3, 5), 115.3 (d, C-8), 28.9 (q, C-10); iH-NMR(CDCl3， 400 MHz, δ):7.43 (2H, d, J = 8.4 Hz, H-2,6); 6.90 (2H, d, J = 8.4 Hz, H-3, 5), 7.25 (IH, d, J = 16.0 Hz, H-7 Hz), 6.59 (IH, d, J = 16.0 Hz, H-8 Hz), 2.3 (3H, s, C也-10)。
[0016] 对径基苯甲醒：?3〇醒R (MeOD, 100 MHz, δ): 191.4 (d, C-7, )，163.2 (s, C-7), 132.3(d, C-2, 6)， 128.9 (s, C-1), 115.9 (d, C-3, 5);1H-醒R (MeOD, 400 MHz, δ)： 9.71 (s, H-7), 7.68 (d, J = 8.5 Hz, H-2 6)6.85 (d, J = 8.5 Hz, H-3, 5) 。
[0017] 对径基苯甲酸：UC-NMR(MeOD, 100 MHz, δ): 169.4 (s，C-7) ,163.2 (s, c- 4)， 133.2 (d, C-2,6), 122. 8 (s, C-1), 116. 3 (d, C-3, 5);1h NMR (MeOD, 400 MHz, δ): 7.85 (2H, d, J = 8.5 Hz, H-2,6)，6.81 (2H, d, J = 8.5 Hz, H-3,5)。
[001 引对径基苯甲酸甲醋：?30 匪 R (CDCh，100 MHz, δ): 167.5 (s, C-7), 161.2 (s, C-4), 131.8 (d, C-2,6), 115.2 (d, C-3,5), 121.6 (s, C-1), 51.7 (q, C-8); iH-NMR (CDCh， 400 ΜΗζ,δ): 7.87 (2H, d, J = 8.8Hz), 6.81 (2H, d, J = 8.8Hz), 3.83 (3H, s)0