一种从废弃蛹虫草培养基中酶解辅助提取虫草素的方法
【技术领域】
[0001]本发明公开了一种从废弃蛹虫草培养基中酶解辅助提取虫草素的方法，属于虫草素制备技术领域。
【背景技术】
[0002]虫草菌素又称虫草素、蛹虫草菌素，3’-脱氧腺苷，它是第一个从真菌中分离出来的核苷类抗菌素。其分子量为251.24，熔点230?231°C，溶于水、热乙醇和甲醇，不溶于苯、乙醚和氯仿，紫外光的最大吸收波长为259nm。虫草素有抗肿瘤、抗白血病、抗菌、免疫调节、清除体内自由基等多方面的药理作用。另据报道，虫草素一方面具有对DNA和RNA合成过程、加RNA和mRNA转录后修饰过程及腺苷酸环化酶活化等三方面的抑制作用，另一方面它又能促进细胞分化，重建细胞骨架。虫草素有降低胆固醇、降血糖、抗感染、抗疟原虫、抗蚊虫的作用，含虫草素的虫草发酵液对哮喘及支气管疾病、肾衰竭病人的肾功能等方面都有良好的辅助治疗效果。目前，在国际市场上虫草素的纯品价格为25000美元/g。我国蛹虫草栽培普遍，但多以菌丝体或子实体的形式入药，因此，研究虫草素的提取工艺具有重要的经济价值和广阔的市场应用潜力。
[0003]目前，虫草素主要通过生物合成的方法经由两条途径获得:一是直接从蛹虫草子实体中提取;二是通过蛹虫草液体发酵，从发酵液中提取。虫草素的获得主要从蛹虫草子实体中提取，但子实体中含量只有0.2?0.6%，提取效率不高，且生产周期长，因此虫草素生产成本极高，价格昂贵；另外的蛹虫草液体发酵对工艺条件要求严格，设备投入较大，发酵后产生的废液处理难度大。
【发明内容】
[0004]本发明主要解决的技术问题:针对目前传统方法在提取虫草素的过程中，虽然蛹虫草子实体中提取和蛹虫草液体发酵提取均可以得到虫草素，但是在虫草子实体中提取中实体含量低，成本极高，导致提取率较低，另外蛹虫草液体发酵对于工艺调节要求严格，设备投入大，且后续产生的废液处理难度大的现状，提供了一种以废弃蛹虫草培养基为原料，首先经高压处理后经中性蛋白酶酶解，再加热水灭酶浸提，通过树脂吸附除杂后透析浓缩，冰浴结晶后冻干，从而得到从废弃蛹虫草培养基中酶解辅助提取虫草素的方法。该方法操作简便，无需特殊设备，以含有菌丝的废弃蛹虫草固体培养基为原料，不仅节约了资源，实现了废物利用，而且降低了生产成本，最终使得虫草素提取得率达到0.70?0.80%，虫草素纯度达到99 %以上，适合大规模生产应用。
[0005]为了解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案是:
(1)称取500?600g废弃蛹虫草培养基放入组织粉碎机中以4000?5000r/min转速粉碎后过50?60目标准筛，将过筛后的培养基碎料放入真空脱气机脱气处理15?20min后再经超高压设备在250?350MPa压力下保压I?2h后，得到预处理后的废弃蛹虫草培养基碎料；
(2)将上述预处理后的废弃培养基碎料和蒸馏水按体积比为1:3进行混合后装入陶瓷酶解罐中，加入酶解底物总质量I?2%的中性蛋白酶，用搅拌棒将底物和蛋白酶混合均匀，并用浓度为0.5mol/L柠檬酸溶液调节pH至5?6，用保鲜膜密封罐口后，放入恒温箱，在45?55°C下保温酶解I?2h;
(3 )酶解结束后再向酶解罐中加入底物体积I/2的蒸馏水，再将酶解罐放入油浴锅中，加热升温至100?105°C，进行灭酶处理并保持温度热提I?2h，热提结束后过滤分离得到滤液；
(4)将上述滤液过阳离子型交换树脂吸附柱，过柱完成后用8?10倍树脂体积的去离子水进行洗柱并收集洗脱液；
(5)量取400?500mL上述收集得到的洗脱液装入半透膜制成的透析袋中，再将透析袋呈垂直状放入体积为IL的玻璃杯中，向玻璃杯中加入无水硫酸钠粉末使其将透析袋完全覆盖，静置脱水浓缩I?2h，得到虫草素提取浓缩液；
(6)将上述得到的虫草素提取浓缩液放入旋转蒸发器中，在40?50°C下继续旋蒸浓缩15?20min后放置在4?6°C的冰水浴中静置过夜结晶，过滤得到结晶体后，再用真空冻干机干燥后研磨成粉，过200目标准筛后即得虫草素成品。
[0006]所述的阳离子型交换树脂是732型阳离子型交换树脂。
[0007]本发明的应用方法是:将本发明制得的虫草素成品通过胶囊仪器，制成虫草素胶囊，其中每个胶囊中含有I?2g虫草素，食用时，配以250?300mL温水送服，每日早晚饭后服用一次，每次服用I?3粒，坚持服用7?14天，可以感觉人体抵抗力得到了提高，有助于延缓衰老。
[0008]本发明的有益效果是:
(1)本发明方法独特新颖，以含有菌丝的蛹虫草固体培养基为原料，避免了资源的浪费，降低了生产成本，实现了废物利用；
(2)本发明工艺简便，无需特殊设备，使得虫草素提取得率达到0.70?0.80%，虫草素纯度达到99 %以上，适合大规模生产应用。
【具体实施方式】
[0009]首先称取500?600g废弃蛹虫草培养基放入组织粉碎机中以4000?5000r/min转速粉碎后过50?60目标准筛，将过筛后的培养基碎料放入真空脱气机脱气处理15?20min后再经超高压设备在250?350MPa压力下保压I?2h后，得到预处理后的废弃蛹虫草培养基碎料;然后将上述预处理后的废弃培养基碎料和蒸馏水按体积比为1:3进行混合后装入陶瓷酶解罐中，加入酶解底物总质量I?2%的中性蛋白酶，用搅拌棒将底物和蛋白酶混合均匀，并用浓度为0.5mol/L柠檬酸溶液调节pH至5?6，用保鲜膜密封罐口后，放入恒温箱，在45?55 °C下保温酶解I?2h ；酶解结束后再向酶解罐中加入底物体积I/2的蒸馏水，再将酶解罐放入油浴锅中，加热升温至100?105°C，进行灭酶处理并保持温度热提I?2h，热提结束后过滤分离得到滤液;接下来将上述滤液过阳离子型交换树脂吸附柱，过柱完成后用8?10倍树脂体积的去离子水进行洗柱并收集洗脱液;随后量取400?500mL上述收集得到的洗脱液装入半透膜制成的透析袋中，再将透析袋呈垂直状放入体积为IL的玻璃杯中，向玻璃杯中加入无水硫酸钠粉末使其将透析袋完全覆盖，静置脱水浓缩I?2h，得到虫草素提取浓缩液;最后将上述得到的虫草素提取浓缩液放入旋转蒸发器中，在40?50°C下继续旋蒸浓缩15?20min后放置在4?6°C的冰水浴中静置过夜结晶，过滤得到结晶体后，再用真空冻干机干燥后研磨成粉，过200目标准筛后即得虫草素成品。所述的阳离子型交换树脂是732型阳离子型交换树脂。
[0010]实例I
首先称取500g废弃蛹虫草培养基放入组织粉碎机中以4000r/min转速粉碎后过50目标准筛，将过筛后的培养基碎料放入真空脱气机脱气处理15min后再经超高压设备在250MPa压力下保压Ih后，得到预处理后的废弃蛹虫草培养基碎料;然后将上述预处理后的废弃培养基碎料和蒸馏水按体积比为1: 3进行混合后装入陶瓷酶解罐中，加入酶解底物总质量1%的中性蛋白酶，用搅拌棒将底物和蛋白酶混合均匀，并用浓度为0.5mol/L柠檬酸溶液调节pH至5，用保鲜膜密封罐口后，放入恒温箱，在45 °C下保温酶解Ih;酶解结束后再向酶解罐中加入底物体积1/2的蒸馏水，再将酶解罐放入油浴锅中，加热