一种融合蛋白及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明设及基因工程技术领域，特别是设及一种融合蛋白及其应用。
【背景技术】
[0002] 天花粉蛋白（TrichosanthinJCS)是从葫芦科括楼属植物括楼（Trlchosanthes Kirilowii Maxim)的根块中提取出的一种碱性蛋白，属于I型核糖体失活蛋白。传统中药天 花粉在我国已有上千年的药用历史，历代古医书中对其性状和应用都有详细的记载。天花 粉蛋白最初临床上主要用于引产及宫外孕等，后来陆续发现它具有广泛的药理作用，包括 抗病毒，抗肿瘤作用等，其中天花粉蛋白的抗肿瘤作用尤为引人注目。实验表明，天花粉蛋 白对化La细胞的生长具有明显的抑制作用，可W将化La细胞阻滞于S期，诱导化La细胞发生 调亡（何金峰，李继承.天花粉蛋白抑制化La细胞生长及诱导细胞调亡之机制探讨.解剖学 报.2006,37:309)。
[0003] 然而，天然提取的和基因工程表达的未经修饰的天花粉蛋白用于抗肿瘤治疗遇到 的一个突出问题是，并非所有类型的肿瘤都对天花粉蛋白的细胞毒效应敏感。研究显示，宫 颈癌来源的化La细胞对天花粉蛋白敏感，而肝癌来源的化pA-H细胞则不敏感。对运些不敏 感的肿瘤，如果单纯采用增加天花粉剂量的方法，则有可能导致临床上无法接受的毒副反 应。运种反应的差异性大大限制了天花粉蛋白作为抗肿瘤药物的使用范围和效能。
[0004] -般认为，天花粉蛋白对不同细胞的毒性的差异取决于它能够穿过细胞膜到达细 胞内祀位点的效率，而它的跨膜转运是由膜受体介导的。因此，如何将天花粉蛋白在分子水 平加 W改造，使其能够高效进入肿瘤祀细胞，W通过减量增效而降低其毒副反应，扩大其抗 肿瘤临床应用范围，具有至关重要的意义。
[0005] 在肿瘤生物治疗研究和临床实践中，采用蛋白质转导技术可将治疗蛋白高效转导 进入祀细胞。蛋白质转导技术是将目的蛋白与一段"蛋白转导肤"（或称"细胞穿透肤"）在分 子水平连接，构成融合蛋白。运样的融合蛋白能自动穿过细胞膜进入细胞内，而毋需任何其 它辅助试剂。迄今已发现多种具有蛋白转导活性的蛋白或肤成分，但其中研究得最为深入 的是衍生于艾滋病毒化IV)的TAT转导肤。
[0006] 自从蛋白质转导技术发明W来，TAT肤一直是应用最广、研究最深入的细胞转导 (穿透)肤。然而，2007年美国哈弗大学的化vid R丄iu实验室通过研究绿色巧光蛋白（GFP) 的分子表面结构，发现在不影响蛋白巧光特性的前提下，把非保守氨基酸替换成一些带正 电荷或负电荷的氨基酸，得到一些"超电荷蛋白"化awrence MS,化illips KJ,Liu DR. Supercharging proteins can impart unusual resilience.J Am Chem Soc.2007; 129(33): 10110-2)。运样的超电荷蛋白不仅保持原有的巧光等性能，而且获得了一些不同 寻常的新的特性。经过基因工程改造而使表面带有36个正电荷的超正电荷绿巧光蛋白（+ 36GFP)由于静电排斥作用，使蛋白溶液具有更高的稳定性或抗变性特性，而最引人注目的 是，+36GFP及其偶联的融合蛋白也具有细胞转导/穿透效能，而且其细胞转导/穿透效能比 经典的TAT肤高100倍（Cronican JJ,et al.Potent delivery of functional proteins into Mammalian cells in vitro and in vivo using a supercharged protein.ACS Chem Biol.2010:5(8) :747-52),成为迄今最强效的细胞转导/穿透元件。
[0007] CN105315377A公开了带有穿膜肤的天花粉(TCS)融合蛋白、质粒及制备方法与应 用。融合蛋白包括TCS与穿膜肤，所述的穿膜肤为人源性穿膜肤，选自ARF、皿D或TAT，所述的 融合蛋白中还含有连接肤，所述的连接肤为2个氨基酸到20个氨基酸长度的连接肤，优选为 柔性的连接肤。同时，可将带有穿膜肤的TCS融合蛋白用在制备抗肿瘤药物中。该发明公开 的带有穿膜肤的TCS融合蛋白对部分肿瘤细胞的穿膜能力仍然较弱，例如，该发明将人超氧 化物歧化酶C端部分氨基酸化BD)作为穿膜肤与TCS融合，构建的融合蛋白对人肺癌A549细 胞株的半数抑制浓度(IC50)为3.祉M，用药剂量仍然较高，所W需要使TCS穿膜能力更强的穿 膜肤(细胞转导/穿透元件），从而开发出用药剂量更低的TCS融合蛋白。
【发明内容】
[0008] 本发明针对现有技术的不足，提供了一种W超正电荷绿色巧光蛋白为细胞转导/ 穿透元件的融合蛋白及其应用。
[0009] 一种融合蛋白，包括超正电荷绿色巧光蛋白（+36GFP)、流感病毒血凝素 HA2亚基和 天花粉蛋白（TCS)。超正电荷绿色巧光蛋白，能够使融合蛋白穿透细胞膜进入细胞内；流感 病毒血凝素 HA2亚基，能够裂解囊泡膜将被内吞体包裹的融合蛋白释放进细胞浆，从而可W 加快融合蛋白发挥作用的速度;天花粉蛋白，能够透过调亡机制杀伤祀细胞。
[0010]所述各元件之间直接连接或者通过连接肤化inker)进行连接。考虑到+36GFP和 TCS两部分分子量较大，可能会造成他们在功能上的互相影响，同时也会带来一些其他问 题，如表达量低W及W包涵体形式表达等。优选的，所述的融合蛋白，包括连接肤。连接肤不 宜太短或太长，一般W柔性的谷氨酸和丝氨酸为主。优选的，所述的连接肤氨基酸序列如 沈Q ID No.5所示。
[0011] 由于所述各元件为独立发挥作用，只要保证最终的融合蛋白具有较好的蛋白折叠 状态和功能，各元件排列的先后顺序可W变换。考虑到各元件发挥作用的先后顺序，优选 的，所述的融合蛋白，由超正电荷绿色巧光蛋白、流感病毒血凝素 HA2、连接肤和天花粉蛋白 依次连接组成。
[0012] 为了融合蛋白纯化的方便，可W使用亲和纯化标签。作为一种优选，所述的融合蛋 白，包括组氨酸标签序列。
[0013] 所述融合蛋白，超正电荷绿色巧光蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，天花粉 蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No. 2所示，流感病毒血凝素 HA2亚基的氨基酸序列如SEQ ID No. 3所示。
[0014] 本发明又提供了一种编码所述融合蛋白的基因。
[001引所述的基因，核巧酸序列如沈Q ID No.4所示。
[0016] 本发明还提供了包含所述基因的重组载体和转化子。
[0017] 本发明还提供了所述的融合蛋白在制备抗肿瘤药物中的应用。
[0018] 优选的，所述肿瘤为肺癌或黑色素瘤。
[0019] 本发明将超正电荷绿色巧光蛋白、流感病毒血凝素 HA2亚基与天花粉蛋白融合，获 得的融合蛋白能高效穿过细胞膜进入肿瘤细胞，大大增强了其抗肿瘤活性，降低有效药物 浓度。
【附图说明】
[0020] 图1为+36GFP-HA2-TCS融合基因的构建流程图；
[0021 ]图2为重组质粒构建分子克隆流程图；
[0022] 图3为重组质粒祀T+36GFP-HA2-TCS图谱示意图；
[0023] 图4为融合蛋白+36GFP-HA2-TCS蛋白表达SDS-PAGE电泳图，其中，M:蛋白标准分子 量Marker，一:阴性对照组(未转化的化21菌），1-4:1-4号菌落IPTG诱导表达前，1/ -少：1-4 号菌落IPTG诱导表达后；
[0024] 图5为融合蛋白+36GFP-HA2-TCS蛋白表达样品Western blotting图，其中，M:蛋白 标准分子量Marker，1: TCS蛋白注射液（1.2mg/mL)，2: TCS蛋白粉末溶液（1. Omg/mL)，3:未转 化的化21菌体，4: PET+36GFP-HA2转化菌体，5: PET+36GFP-HA2-TCS转化菌体；
[00巧]图6为化spase3/7测定法检测融合蛋白+36GFP-HA2-TCS作用于人肺癌A549细胞株 的结果图；
[00%] 图7为化spase3/7测定法检测融合蛋白+36GFP-HA2-TCS作用于小鼠黑色素瘤B16 细胞株的结果图；
[0027] 图8为结晶紫染色检测融合蛋白+36GFP-HA2-TCS肿瘤杀伤作用结果图；
[0028] 图9为MTT实验检测融合蛋白+36GFP-HA2-TCS抑制人肺癌A549细胞株细胞生长结 果图；
[0029] 图10为MTT实验检测融合蛋白+36GFP-HA2-TCS抑制小鼠黑色素瘤B16细胞株细胞 生长结果图，药物作用时间为36h。
【具体实施方式】
[0030] 实施例1
[0031] (1 )PCR 扩增+36GFP-HA2 和 TCS 片段
[0032] 设计扩增+ 3 6 G F P - Η A 2片段的引物，上游引物+ 3 6 G F P - F为： gctacaagggatccgctggctccg (包含BamHI酶切位点序列）；下游引物+36GFP-HA2-R为： tc曰t曰g曰曰CC曰CC曰g曰曰CC曰CC曰g曰曰CC曰CC曰g曰曰CC曰CC曰tc曰曰tc曰tgccttccc曰g(包含Linker序列）。 W祀T+36GFP-HA2质粒化awrence MS，et al.J Am Chem Soc.2007;129:10110)为模板，上 游引物+36GFP-F和下游引物+36GFP-HA2-R为引物，扩增+36GFP-HA2片段。
[0033] 设计扩增T C S基因的引物，上游引物T C S - F为： tt邑at邑邑t邑邑ttct邑邑t邑邑ttct邑邑t邑邑ttct邑邑t邑邑ttct邑at邑tta邑cttcc邑???3?ο(^·#Ι?η1?θΓ；^ 列）；下游引物TCS-R为：accagactcgagtcattat1:atgccatattgtttc1:attc(包含趾〇1 酶切位点 序列）。W包含TCS基因的质粒地C-TCS为模板，上游引物TCS-F和下游引物TCS-R为引物，扩 增TCS基因。
[0034] PCR反应体系如下：