一种胸腺肽α1的融合蛋白的制作方法

文档序号:9903563阅读:668来源:国知局
一种胸腺肽α1的融合蛋白的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物工程制药技术领域,具体设及一种胸腺肤α1的融合蛋白。
【背景技术】
[0002] 胸腺肤α1是一种具有免疫调节作用的小分子活性多肤,Goldstein在20世纪70年 代末期从胸腺生成素第5组分(W5)中分离纯化出一种小分子生物活性多肤,具有胸腺肤类 似的生物活性,命名问胸腺肤日1,它由28个氨基酸组成,Ac-Ser-Asp-Ala-Ala-Val-Asp- Thr-Ser-Ser-Glu-Ile-Thr-Thr-Lys-Asp-Leu-Lys-Glu-Lys-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Val- Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn-OH。胸腺版α1现已广泛应用于临床,主要用于原发性和继发性 免疫缺陷症,如慢性乙型肝炎、重症乙型肝炎、抗病毒治疗AIDS等,并用作各种恶性肿瘤前 期化疗、放疗的辅助用药。然而,现有临床上使用的胸腺肤α1存在半衰期短激发或引起肿瘤 部位的免疫抵抗作用低等缺点。
[0003] 免疫球蛋白IgG是血液中最丰富的蛋白质之一,其在血液中的半衰期长达21天。免 疫球蛋白一般由四肤链组成的,即由二条相同的分子量较小的轻链化链,约25kd)和二条相 同的分子量较大的重链化链,约50kd)组成的经由二硫键连接形成一个四肤链分子。IgG的L 链具有一个可变区(LH)和恒定区LH。
[0004] IgG的Η链各有一个可变区(VH)和Ξ个恒定区(CH1、CH2和CH3)和位于CH1和CH2之 间的较链区等功能区构成。VL和VH是与抗原结合的部位,CH2具有补体Clq结合点,能活化补 体的经典活化途径;CH3具有结合单核细胞、巨隧细胞、粒细胞、B细胞和NK细胞Fc受体的功 能。
[0005] 免疫球蛋白恒定区Fc主要是由CH2和CH3组成。当抗原与抗体结合后,Fc可与化受 体(FcR)结合,激活补体系统,在抗体依赖性细胞吞隧作用,抗体依赖性细胞介导的细胞毒 性,刺激炎症反应等方面发挥重要重要作用。有文献报道将化与临床上一些重要的细胞因 子,如白介素-2,凝血因子VIII,或与可溶性受体,如肿瘤坏死因子受体胞外区结合成融合 蛋白,可W延长原型因子或受体的循环半衰期和或增加原有的生物活性(Peppel K, Crawford D,Beutler B.A tumor necrosis factor(TNF)receptor-IgG heavy chain chimeric protein as a bivalent antagonist of TNF activity.J Exp Med.1991Dec 1:174(6):1483-9.)。

【发明内容】

[0006] 本发明目的在于提高一种胸腺肤α1的融合蛋白,由胸腺肤α1或其活性片段,通过 连接肤或者直接与免疫球蛋白恒定区连接而成。该融合蛋白既可W在真核细胞也可W在原 核细胞表达。本发明用重组DNA技术制备了含有目的基因的原核载体,并在大肠杆菌中表达 和分离纯化,所获胸腺肤曰1的融合蛋白与原型胸腺肤曰1相比,具有更长的体内半衰期和更 高效抗肿瘤效果。
[0007] 本发明具体技术方案如下: 一种胸腺肤α1的融合蛋白,由胸腺肤α1或其活性片段,通过连接肤或者直接与免疫球 蛋白恒定区连接而成。
[0008] 优选的,所述免疫球蛋白恒定区是免疫球蛋白重链的恒定区。
[0009] 优选的,所述免疫球蛋白是人IgG4,进一步优选包含免疫球蛋白绞链区,恒定区 C肥和恒定区C册。
[0010] 优选的,所述胸腺肤α1或其活性片段的氨基酸序列如SEQ ID N0:1或2所示,或者, 将SEQ ID NO: 1或2所示氨基酸序列的C端氨基酸残基替换为原氨基酸残基之外的十九种天 然氨基酸的任何一种,或者缺失。二十种天然氨基酸为甘氨酸、丙氨酸、鄉氨酸、亮氨酸、异 亮氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、色氨酸、丝氨酸、酪氨酸、半脫氨酸、蛋氨酸、天冬酷胺、谷氨酷 胺、苏氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、赖氨酸、精氨酸和组氨酸。
[0011] 优选的,所述胸腺肤α1或其活性片段的N端是乙酷化的或非乙酷化的。
[0012] 优选的,所述免疫球蛋白恒定区氨基酸序列如SEQ ID Ν0:3所示。
[0013] 本发明所述的胸腺肤α1的融合蛋白,优选氨基酸序列如SEQ ID Ν0:4所示。
[0014] 本发明的另一目的在于提供本发明所述的胸腺肤α1在制备治疗原发性和继发性 免疫缺陷症和抗肿瘤药物中的应用。
[0015] 优选的,所述免疫缺陷症包括慢性乙型肝炎、重症乙型肝炎、艾滋病,所述肿瘤为 黑色素瘤。
[0016] 本发明所述的胸腺肤α1的融合蛋白可通过如下方法多制备得到: (1)基因的获取 利用基因合成的方法获得胸腺肤α1或其活性片段,通过连接肤或者直接与免疫球蛋白 恒定区所对应的核巧酸序列其互补序列。
[0017] (2)将合成的基因与原核表达载体连接,转化大肠杆菌,W乳糖进行诱导表达。
[0018] (3)将表达产物进行分离纯化。
[0019]本发明优点: 药效学试验证明本发明的融合蛋白与原型胸腺肤α1相比具有较强的抗肿瘤作用和更 长的体内半衰期。
【附图说明】
[0020] 图1是SDS-PAGE分析纯化本发明所述胸腺肤α1融合蛋白(其中Μ:分子量标记,1:诱 导表达1小时的重组胸腺肤曰1融合蛋白,2:诱导表达2小时的重组胸腺肤α1融合蛋白,3:诱 导表达4小时的重组胸腺肤α1融合蛋白,4:诱导表达4小时的重组胸腺肤α1融合蛋白。
[0021] 图2是本发明胸腺肤α1融合蛋白体内抑制黑色素瘤效果。
【具体实施方式】
[0022] 实施例1胸腺肤α1融合蛋白表达载体的构建 利用基因合成的方法获得SEQ ID NO: 1和SEQ ID NO:3所对应的核巧酸序列的互补序 列SEQ ID ^):5序列两端设计了齡〇1和化11(1111酶切位点,且化〇1和化11(1111酶切位点的5' 端各设计了 Ξ个鸟嚷岭保护碱基,将互补序列进行94°C变性5min,54°C退火lOmin,然后进 行Ncol和化ndlll酶切,克隆到原核表达载体祀T32a,转化至大肠杆菌,聚合酶链法筛选阳 性转化子。聚合酶链法引物为: P1:5 ' 一CCATGGCTAGCGATGCGGCCGTGGAT- 3 ' 沈Q ID NO:6 P2:5 ' 一AAGCTTTTATTTACCCGGAGACAGGG-3 ' 沈Q ID NO: 7 聚合酶链法扩增体系为: 引物P 1 (化ymol/L)和引物P2(25ymol/L)各 lOyiaOXPCR反应缓冲液(Mg
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