一种毒杀华北大黑鳃金龟的球孢白僵菌及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明设及一种微生物菌株，具体地说是一种球抱白僵菌菌株及其在防治华北大 黑觸金龟中的应用。
【背景技术】
[0002] 金龟子是地下害虫中最大的类群，也是危害最重、造成损失最大的种类，是粮田作 物、油料作物、果林苗圃、蔬菜及特种作物的重要经济害虫之一。金龟子在我国种类繁多，为 害农作物的金龟子种类已记载的有100余种，其中华北大黑觸金龟在我国发生的广泛性 和严重性居首位，主要分布在东北、华北、西北等省区，主要为害马铃馨、甘馨、大豆、花生、 玉米，草坪、苗圃W及杨、柳、桑、核桃、苹果等林木。
[0003] 华北大黑觸金龟成虫咬食植物叶片，使叶片成网状孔桐和缺刻，严重时仅剩主脉， 群集为害时更为严重。成虫昼伏夜出，一般在傍晚6点至7点左右出±，在地面爬行或做 短距飞翔，在此过程中交尾取食，晚上8点至9点达到取食交尾高峰。成虫将卵产在地 下，虫卵解化后进入幼虫阶段，幼虫俗称蛇蜡，共分为3龄。幼虫食性很杂且食量大，取食多 种植物的种子、果实、根茎等，常造成幼苗枯死，轻则缺苗断垄，重则毁种绝收。但由于幼虫 在地下为害，具有隐蔽性和滞后性，防治起来相当困难。
[0004] 长期W来，对于华北大黑觸金龟的防治主要依赖于化学农药，比较有代表性的高 效中低毒化学农药有毒死婢、化虫嘟、辛硫憐和下硫克百威等药剂。运些药剂对金龟子的防 治效果较为显著，但长期使用化学农药对金龟子进行防治造成环境污染日趋严重，害虫抗 药性提高及产品农药残留等问题也日益加剧，因此采用生物防治等方法治理金龟子是十分 必要的。
[0005] 在我国针对金龟科害虫的生物防治中，研究与应用最多的主要有白僵菌和绿僵菌 等昆虫病原真菌，并且对多种金龟害虫的防治也取得了明显成效，但防治对象多局限于金 龟幼虫蛇蜡，对成虫有效的白僵菌未见报道。另一方面，白僵菌菌株寄生专化性很强，同一 菌株对不同科金龟害虫致病力差异明显，对同一种金龟害虫不同虫态的致病力差异也较 大。目前，对华北大黑觸金龟成虫和幼虫同时有效的生防菌株的研究未见报道。
[0006] 华北大黑觸金龟成虫在五、六月份交尾，此时在我国北部地区平均溫度为15~30 °C，适合白僵菌生长发育。每只华北大黑觸金龟雌虫共可产卵32-193粒，平均102粒，一旦 白僵菌感病致死一只金龟成虫，理论上相当于感染更多的金龟幼虫，同时白僵菌在虫尸上 的繁殖在一定程度上可继续侵染下一代害虫。因此，在金龟害虫的综合防控中，对金龟成虫 和幼虫同时具有高致病力的菌株可W最大限度的发挥白僵菌的致病作用，对更好地发挥生 物农药的作用、减少化学农药用量及降低蛇蜡抗药性等均具有重要意义。
【发明内容】
[0007] 本发明的目的是提供一种球抱白僵菌菌株，该菌株针对华北大黑觸金龟幼虫和成 虫均具有高毒杀能力，能够应用于华北大黑觸金龟的生物防治。
[000引本发明所提供新菌株为球抱白僵菌(Beauveria bassiana)JCF，该菌株已于2015 年9月8日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中屯、(地址:北京市朝阳区北 辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所），保藏编号为CGMCC No. 11338。
[0009] 2014年河北省农林科学院植物保护研究所在室内饲养华北大黑觸金龟的过程中， 在自然感病成虫上分离纯化得到一株白僵菌菌株，编号为JCF。将JCF菌株接种在SDAY(蛋白 腺10 g，酵母10 g，葡萄糖40 g，琼脂15 g，蒸馈水1L，自然pH)平板培养基上，观察菌株生物 学特征。结果显示，在SDAY培养基上，菌落初期白色绒状，后变为黄色或浅黄色絮状，背面无 色，培养15d左右开始产生分生抱子，产抱细胞单生，产抱时浅黄色，分生抱子呈亚圆形，直 径2.0 -3.5 X 1.5 - 3.0 μπι。从W上特征看，菌株JCF为球抱白僵菌。JCF菌株抱子及菌丝 照片如图1所示。
[0010] 进一步的分析结果表明，与JCF菌株ITS序列最为接近的为球抱白僵菌，其ITS序列 同源性为97%，结合JCF菌株的形态学特点，将该菌株鉴定为球抱白僵菌。
[0011] 在室内采用浸溃法测定JCF菌株对华北大黑觸金龟幼虫的毒力(表1、2、3)。结果显 示：（1 )JCF菌株对低龄幼虫的致病力高于高龄幼虫；（2)对于同一龄期的幼虫，随着感染浓 度的增高，JCF菌株对幼虫的杀虫活性随之增强；（3)在较高接种浓度下，幼虫5 d后即出现 死虫，15 d~20 d达到侵染高峰期。（4)浓度1 X 108抱子/mL的JCF抱悬液对华北大黑觸金龟1 龄、2龄、3龄幼虫20天的累计死亡率分别为93.3 %，56.7%，52.4%; 5 X 108抱子/血的抱悬液 对华北大黑觸金龟2龄、3龄幼虫20天的累计死亡率分别为85.5%，77.9%。
[0012] 在金龟幼虫的田间防治中主要采用诱灌或沟施的方法，在室内模拟田间诱灌方式 测定白僵菌JCF对华北大黑觸金龟幼虫的毒力(表4)，由于±壤的稀释作用，同时虫体粘附 菌体需要一定的时间，施菌后第10天，JCF菌株对2龄、3龄幼虫的致死率仅为52.3%、22.5%， 15 d后2龄、3龄幼虫的累计死亡率分别为71.5%、40.0%，25d后对2龄、3龄幼虫的致死率分别 为92.5%、89.5%。从长期效果来看，JCF菌株对华北大黑觸金龟幼虫的致病效果明显。
[0013] 应用JCF菌株对华北大黑觸金龟成虫进行毒力测试。结果(表6)显示，在室内恒溫 条件下JCF菌株对华北大黑觸金龟成虫的杀虫活性高于幼虫，且侵染时间短。IX 108抱子/ mL浓度下，施菌第8 d后，金龟成虫的累计死亡率即达到86.7%。室内自然变溫条件下（室内 罩笼试验）（表7)第10 d成虫的累计死亡率在90%W上。田间罩笼10 d后(表8)，成虫的累计 死亡率为70.6%。表明JCF菌株对华北大黑觸金龟成虫有较强的致病力，说明该菌株可作为 生产性菌株应用于防治华北大黑觸金龟。图2为JCF菌株感染的华北大黑觸金龟幼虫及成 虫。
[0014] 上述毒力测试表明，JCF菌株对銷翅目金龟科害虫华北大黑觸金龟成虫和幼虫均 具有较高的杀虫活性，因而，可W将本发明球抱白僵菌JCF制成杀虫剂，用于华北大黑觸金 龟的防治，从而降低化学农药的使用量，减少环境污染，具有重要的经济价值和应用前景。
【附图说明】
[0015] 图1为JCF菌株分生抱子； 图2为JCF菌株菌丝； 图3为JCF菌株菌落； 图4为JCF侵染的2龄金龟幼虫； 图5为JCF侵染的3龄金龟幼虫； 图6为JCF侵染的金龟成虫。
【具体实施方式】
[0016] 实施例1:JCF菌株获取的工作流程 自然感病僵虫^直接分离纯化菌株^接种华北大黑觸金龟测定杀虫毒力^获得高毒 力菌株JCF^菌株形态、抱子形态、鉴定^提取菌株DNA，W真菌ITS序列通用引物扩增菌株 DNA，将获得的扩增序列测序并在GenBank中对比一确定菌株JCF为球抱白僵菌。
[0017] 实施例2: JCF菌株的筛选分离过程 2014年河北省农林科学院植物保护研究所在饲养华北大黑觸金龟过程中，发现自然感 病死亡、体表具白色菌丝的金龟成虫，保湿处理后，感病成虫体表产生淡黄色抱子，经分离 纯化得到一株白僵菌，编号为JCF。后将抱子接种在SDAY(蛋白腺10 g，酵母10 g，葡萄糖40 g，琼脂15 g，蒸馈水1 000血，自然抑)平板培养基上培养至产生分生抱子，收集分生抱子， 冷冻干燥后4°C备用。
[0018] 实施例3:菌株培养及抱悬液配制 将JCF菌株接种于SDAY平板培养基上，26 ± rC恒溫光照（1化：12D)培养，抱子成熟后， 收集抱子并置于装有玻璃珠的0.02% (v/v)吐溫-80水溶液中，振荡揽拌约30 min,待抱子 完全均匀打散后经4层纱布过滤，获得纯抱子悬浮液，血球计数板计数并配制成梯度浓度的 抱悬液，用于致病力