一种蔬菜发酵用微生物菌剂产品及其制备
【技术领域】
[0001] 本发明属于微生物制剂生产领域，特别是设及制备一种用于泡菜生产的微生物制 剂及其生产方法。
【背景技术】：
[0002] 泡菜生产所用的微生物主要有两种方法，一种是利用自然发酵法制备泡菜产品， 采用泡菜生产环境中存在的自然菌种生产，国内生产的发酵型泡菜几乎都采用此法，但此 类产品质量不稳定，产品标准极不规范、存在严重食品安全隐患;第二种方法是采用培养的 纯乳酸菌进行生产，其中菌种有植物乳杆菌、干酪乳杆菌和其他乳酸菌，沈国华等于《中国 调味品》2002年第六期发表的"纯菌接种发酵技术在騰溃蔬菜加工上的应用研究（二)纯菌 接种发酵技术最佳发酵模式的确定与应用"，运篇文章报道了采用分别培养的乳酸菌发酵 剂制造泡菜的工艺。但利用纯乳酸菌生产泡菜尚处于试验室研究开发阶段。然而，目前乳酸 菌纯种生产泡菜还处于起步阶段，采用的乳酸菌均为酸奶、乳酸等产品的专有菌种，没有开 发出适合泡菜生产的专用菌种。此类菌群在泡菜制作基质的特定环境中适应性差，生长繁 殖困难，无法酿制出发酵泡菜独有的品位。
[0003] 由于微生物菌种的原因，泡菜的工业化生产受到了较大的限制；面对人们生活水 平的提高和日益增长的市场需求，泡菜生产用微生物制剂的开发对泡菜的工业化开发具有 重要的现实意义。
【发明内容】
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[0004] 本发明解决的技术问题是提供一种用于蔬菜发酵用微生物菌剂。
[0005] 本发明的技术方案概述如下：
[0006] 本发明首先对植物乳杆菌，醋酸杆菌、干酪乳杆菌、酿酒酵母菌种进行单独培养， 培养到预定时间后经离屯、后收集菌体，利用常规微生物制剂的生产方法制备各菌的粉状微 生物菌粉;将制备的菌种粉剂根据各菌制剂活细胞数的含量进行混和调配。
[0007] 蔬菜发酵用微生物菌剂中各菌种的及其重量份数为:植物乳杆菌15-25,干酪乳杆 菌数量为3-6,醋酸杆菌数量为1-3,酵母菌活菌数量为1-2。
[0008] 本发明中复合菌粉的生产如下:首先生产醋酸杆菌、干酪乳杆菌、植物乳杆菌粉状 菌粉，生产步骤如下:将斜面菌种转接到液体培养基并逐级扩培到要求的体积;将扩培得到 的菌液进行离屯、分离，收集沉淀菌体；向沉淀菌体中加入保护剂并进行稀释;利用干燥设备 制备粉状菌剂，上述方法制得植物乳杆菌菌粉中活细胞数为(0.1~9.0) X(l〇w)个/克，干 酪乳杆菌(0.1~9.0) Xl〇iMV克，醋酸杆菌菌粉中活细胞数为(0.1~9.0) X109个/克，另 采用活性干酵母的制造方法制得活性酵母菌粉，其中活性酵母菌数量在(0.05~9.0) Xl〇9 个/克。复合菌粉混合时可W加入淀粉和糊精实现各菌活菌数的合适比例。
[0009] 所述植物乳杆菌为CGMCC 11763。
[0010] 植物乳杆菌益生特性如下：
[0011]本发明所提供的植物乳杆菌CGMCC NO. 11763经实验发现能够在抑为1.50的条件 下存活，在1 %胆盐培养4小时后仍处于存活状态;植物乳杆菌CGMCC NO. 11763降解亚硝酸 盐速度快，分解能力达到10.9mg/h/kg，该菌种在生产泡菜时，整个发酵过程中亚硝酸盐浓 度在4.8mg/kgW下；CGMCC NO. 11763在发酵60h小时后，对胆固醇降解率可达到64.76%。 CGMCC NO. 11763黏附能力测定的自凝集率为95.71 %。
[001 ^ CGMCC NO. 11763对胆固醇降解能力研究和现憶：
[001引取1ml CGMCC NO. 11763母液接种于lOmL的MRS胆固醇液体培养基（胆固醇含量 O.lmg/ml，抑6.2)中，37°C的恒溫静置分别培养20h、40h、60h备用，W接入1血无菌水的MRS 胆固醇培养基为对照，取W上培养不同时间的菌液样品及对照液各lml，9000r/min，4°C下 离屯、lOmin，得到发酵上清液，邻苯二甲醒法测定上清液中胆固醇含量(具体为:取各上清液 0.1ml于相应的试管中，加冰醋酸0.3ml，Img/ml的邻苯二甲醒0.15ml，缓缓加入浓硫酸 1.0ml，混合均匀。室溫静置lOmin，于550nm下测吸光值）。每一处理3个重复，W同样方法制 作胆固醇标准曲线，计算上清液中胆固醇含量及降解率，结果见表1。可知，CGMCC NO. 11763 对胆固醇有很好的降解作用，在发酵60h小时后，降解率可达到64.76%。
[0014] 表1对胆固醇的降解情况
[0015]
[0016] CGMCC NO. 11763菌株的耐胆盐试验：
[0017] 取CGMCCN0.11763菌液ImL接种菌种于含有不同胆盐（含量梯度为0.0 %、0.2 %、 0.4%、0.6%、0.8%、l%)的10血MRS液体培养基(PH=6.4)，置于37°C下分别培养0、2、4h， 每个处理3个重复。各取1ml样品菌液于9ml生理盐水中混匀，制备稀释度溶液，取0.1ml稀释 液于MRS中涂布，于37°C生化培养箱中倒置培养48小时(每个稀释度做3个平行)记录计算平 板上的菌数个数。结果见表2。可知该菌在胆盐浓度为1 %处理4h后菌的生长量依然达到 0.59 + 0.92X 107(；cfu/ml)，有很好的耐胆盐能力。
[001引表2耐胆盐能力检测[(+S) X 107cfu/ml]
[0019]
[0020] CGMCC NO. 11763菌株的耐酸试验
[0021] 取CGMCC NO. 11763母液按1ml接种菌种于不同抑值(抑梯度为1.5、2.0、2.5、3.0、 3.5、4.0)的10血MRS液体培养基，置于37°C下分别培养0、2、4h，每一处理3个重复。各取1ml 样品菌液于9ml生理盐水中混匀，制备稀释溶液，取0.1ml稀释液于MRS中涂布，于37 °C生化 培养箱中倒置培养48小时(每个稀释度做3个平行)记录平板上的菌落个数。结果见表3。说 明该菌具有很强的耐酸能力。
[0022] 表3 耐酸能力检测[(±s) X l07cfu/ml]
[0023]
[0024] CGMCC NO. 11763菌株的黏附能力测定
[0025] 培养CGMCC NO. 11763(MRS液体培养基）、大肠杆菌D册a(LB液体培养基)24h得发酵 液，分别置于3000r/min、4°C下离屯、lOmin，收集菌泥，分别用抑= 7.0的无菌憐酸盐缓冲液 (PBS)洗涂菌泥2次（即在菌落中加入PBS，震荡混合均匀后，置于3000r/min、4°C下离屯、 lOmin，收集菌体）。自凝集率（％ ):用无菌的PBS将菌泥CGMCC NO. 11763制成在波长600皿处 的吸光值为0.4 ±0.1 (A 0)的悬浮菌液及菌悬液，静置24h后测定吸光值A 24,自凝集率 (%)公式为(A 0-A 24)/A 0。；他凝集率（％):将CGMCC ^).11763和大肠杆菌0册〇的悬菌 液调节成在波长600皿处的吸光值为0.6±0.1 (A 0)的混合悬浮菌液。静置24H后测定吸光 值A 24,他凝集率（％ )公式为(A 0 -A 24)/A 0。测定结果见表5,可知CGMCC NO. 11763的自 凝集率为95.71 %，有很强的黏附能力。
[002引表4黏附能力表
[0027]
[0028] 菌株生理特性
[00巧]所述植物乳杆菌(Xactobacillus plantarunOXH于2015年11月30日保藏于中国微 生物菌种保藏管理委员会普通微生物中屯、(简称CGMCC)，保藏号为CGMCC NO. 11763,保藏地 址为：中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编：100101。
[0030] 该菌株特点如下:在显微镜下观察，该菌株为短杆状，革兰氏染色呈阳性，无鞭毛， 不产芽抱;在固体培养基上，该菌菌落为白色，表面光滑，致密，形态为圆形，边缘较整齐。
[0031] 理化特征为:过氧化氨酶(-)，明胶液化(-)，吗I噪实验( + )，运动性(-)，发酵产气 (-)，亚硝酸盐还原(-)，发酵产气(-)，产硫化氨气体(-)，pH4.0MRS培养基中生长(+ )。经过 生理生化鉴定为为植物乳杆菌化actobacillus plantarum)，命名为植物乳杆菌 (Lactobacillus plantarum)XH。
[0032] 菌株能够在57°C下生长良好，葡萄糖耐受能力为275g/L。
[0033] 本发明植物乳杆菌由采集人李建树，从新疆维吾尔族老乡家中酸奶中分离得到， 采集时间2015年6月2日。
[0034] 化发酵罐试验
[0035] (