一株高产嘧啶核苷的菌株及其氨甲酰磷酸合成酶调节位点的制作方法
【技术领域】：
[0001] 本发明属于酶工程技术领域，具体设及一株高产喀晚核巧的菌株及其氨甲酯憐酸 合成酶调节位点。
【背景技术】：
[0002] 喀晚核巧包括尿巧和胞巧，是一切生物体的重要组成成分，它们用途广泛，尤其是 作为抗病毒抗肿瘤药物的中间体，在医药领域占有重要地位。喀晚核巧的生产方法有化学 合成法，水解RNA法和微生物发酵法，综合几种方法的优缺点，微生物发酵法因其周期短、易 控制、产率高、污染小等优点，具有大规模工业化的潜力，因此日益受到人们的重视。
[0003] 喀晚核巧生产菌株的选育始于20世纪60年代，国内外有关喀晚核巧高产菌株的选 育基本上都是诱变结合结构类似物抗性菌株筛选的方法，其中W日本武田化学公司的研究 最为突出。
[0004] 武田公司在高产尿巧菌种选育的过程中先W野生型枯草芽抱杆菌为出发菌株，经 过NTG诱变，选育出一株尿喀晚缺陷型菌株No. 122,该菌株在提供50mg/L尿喀晚情况下，能 够积累乳清酸8.58g/L(50mM)乳清酸和7.78g/L(27mM)乳清酸核巧;在No. 122的基础上，再 次经过NTG诱变，在含有300mg/L 6-氮杂尿喀晚的培养基中筛选到菌株No.258,此菌株积累 尿巧lOg/L，尿喀晚7g/L。继续NTG诱变，在含有5g/L的6-氮杂尿喀晚培养基中筛选到菌株 No . 508，该菌株积累尿巧46g/L，尿喀晚6g/L。最后，为了降低副产物尿喀晚的积累量，继续 进行诱变，筛选到一株尿巧憐酸化酶几乎活性丧失的菌株No. 556，能够积累尿巧55g/L，尿 喀晚积累量<lg/L，通过对培养条件及培养基成分的优化，在6000L发酵罐中稳定积累尿巧 65g/L〇
[0005] 他们对高产胞巧菌种的选育同样基于No. 122菌株。首先通过NTG诱变后，筛选出一 株一株胞巧脱氨酶缺失菌株No. 229，积累胞巧0.2g/L，尿巧Ig/L，此菌株在50mg/L 5-氣胞 巧的存在下即失去生长能力。因此，继续诱变后，获得一株能耐受500mg/L 5-氣胞巧的菌株 No.344,该菌株积累胞巧10.4g/L。经酶活性验证实验得知，此菌株与No. 122菌株相比，氨甲 酷憐酸合成酶和CTP合成酶的活性均提高了十倍W上。经过对该菌株的进一步诱变处理，筛 选出能够耐受12g/L 3-脱杂氮尿喀晚菌株No.428,能够积累胞巧14.2g/L，该菌基本上解 除了 CTP合成酶所受的反馈调节作用。之后，通过同源重组在No.428中引入了突变，获得了 不受反馈抑制的氨甲酯憐酸合成酶菌株No.515,使胞巧产量达到18.8g/L。再经过NTG诱变， 获得了一株高丝氨酸脱氨酶缺失菌株No.615,该菌株能积累胞巧23.5g/L，最后通过对碳源 葡萄糖浓度的调整优化，该菌株在60吨发酵罐中能够积累胞巧30.2g/L，并且产量稳定。
[0006] 而日本武田公司虽然在喀晚核巧高产菌株的选育方法取得了丰硕成果，其选育的 菌种产巧能力也在国际上遥遥领先，但是受当时技术条件限制，他们并没有指出与喀晚核 巧高产息息相关的氨甲酯憐酸合成酶关键调控位点。
[0007] B.subtilis 有两种氨甲酯憐酸合成酶化 C 6.3.5.5, carbamoyl phosphate synthetase，CPSase): -是pyrAA/pyrAB基因编码，催化UMP从头合成途径的第一步反应;二 是carA/ca巧基因编码，参与精氨酸生物合成。虽然，运两种氨甲酯憐酸合成酶都催化谷氨 酷胺与C〇2反应，消耗2分子ATP生成氨甲酯憐酸。但是，B.subtilis的两个氨甲酯憐酸合成 酶生理功能不同，它们的表达和酶活性调节机制也完全不同。
[000引pyrAA/pyrAB位于pyr操纵子的第5和6位，编码与UMP合成相关的氨甲酯憐酸合成 酶。其中pyrAA基因长度为1095bp，编码氨甲酯憐酸合成酶的小亚基，催化谷氨酷胺的ε-氨 基转移到大亚基。pyrAB基因长度为3216bp，编码氨甲酯憐酸合成酶的大亚基，催化MgATP、 C02与N出合成氨甲酯憐酸。pyr AA/pyrAB属于pyr操纵子，其表达也受PRPP激活，受IMP、UDP和 UTP的反馈阻遏。pyrAA/pyrAB编码的氨甲酯憐酸合成酶还是一个变构酶，其酶活受UMP反馈 抑制，受PRPP激活，并需要Mgh的存在。
[0009] 喀晚核巧高产菌株选育的难点在于解除终产物的反馈阻遏和反馈抑制作用，特别 是反馈抑制作用的解除，虽然研究人员已经掲示了喀晚核巧合成代谢具体的调控机制，并 从分子层面上阐述了喀晚操纵子受终产物阻遏的机理，但是对于受终产物反馈抑制的氨甲 酷憐酸合成酶具体的调控位点却并不清楚。
[0010] 随着分子生物学在微生物育种中的应用，有关研究人员也尝试利用PCR法引入点 突变的方法解除氨甲酯憐酸合成酶所受的反馈抑制，但是由于氨甲酯憐酸合成酶结构和功 能的研究并不是太深入，PCR引入点突变的方法在解除氨甲酯憐酸合成酶所受反馈抑制中 的应用受到限制，已经报道的位点对反馈抑制作用的解除效果并不是太明显。
[0011] 本发明提供了一株通过诱变选育出来的具有工业化应用潜力的枯草芽抱杆菌，可 W用于发酵法生产喀晚核巧的相关研究;对菌株的相关基因测序并经过序列比对后，明确 了与氨甲酯憐酸合成酶受终产物反馈抑制相关的关键调控位点，可W为W后喀晚核巧高产 菌株的选育提供参考。
【发明内容】
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[0012] 本发明解决上述问题的技术方案之一：是提供一枯草芽抱杆菌突变株，所述突变 株氨甲酯憐酸合成酶大亚基的第1016位氨基酸为亮氨酸。
[0013] 所述枯草芽抱杆菌突变株具体为枯草芽抱杆菌(Bacillus subtilis)A219。该菌 株已于2015年12月2日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中屯、，地址:北京 市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，邮编100101，保藏编号为CGMCC No.11774。
[0014] 所述枯草芽抱杆菌A219是W-株积累喀晚核巧的枯草芽抱杆菌为出发菌株，通过 常压室溫等离子诱变和喀晚核巧结构类似物抗性菌株筛选而选育出来的，具体步骤如下： W产喀晚核巧的枯草芽抱TD131为出发菌株，进行常压室溫等离子诱变，然后在含300mg/L 2-硫尿喀晚基本培养基上筛选出菌株T823,接着WT823为出发菌株，通过常压室溫等离子 诱变后，在含有lOOmg/L 6-氮杂尿喀晚基本培养基上筛选出菌株A219。
[001引对突变株A219的喀晚核巧操纵子进行测序，并与出发菌株TD131进行序列对比，发 现突变株A219的氨甲酯憐酸合成酶的编码基因发生突变，突变位点在大亚基（调控位点所 在亚基，由pyrAB基因编码)上，A219中pyrAB基因第3047位碱基发生突变，胞喀晚变为胸腺 喀晚，导致氨甲酯憐酸合成酶大亚基1016位的脯氨酸转变为亮氨酸，喀晚核巧操纵子其它 基因未发现突变。
[0016]原始pyrAB基因的核巧酸序列如序列表SEQ ID No.l所示；
[0017] 原始氨甲酯憐酸合成酶大亚基氨基酸序列如序列表SEQ ID No.3所示；
[0018] 突变pyrAB基因的核巧酸序列如序列表SEQ ID No.2所示；
[0019] 氨甲酯憐酸合成酶大亚基突变体氨基酸序列如序列表SEQ ID No.4所示；
[0020] 本发明中核巧酸的位置编号对应序列表SEQ ID No. 1所述核巧酸序列；
[0021] 本发明中氨基酸的位置编号对应序列表SEQ ID No.3所述氨基酸序列。
[0022] 本发明解决上述问题的技术方案之二:是提供一种氨甲酯憐酸合成酶的大亚基编 码基因，所述基因的核巧酸序列如SEQ ID No.2所示。
[0023] 本发明解决上述问题的技术方案之是提供一种喀晚核巧的发酵生产方法，具 体为：WA219为生产菌株，接种量为10 %，培养溫度为34-36 °C，pH 6.7-7.0，溶氧控制在so- so% ，残糖控制在 0.5-1% ，发酵周期 4 她，发酵完成后，发酵液中尿巧浓度可达 13.5±lg/L， 是出发菌株了0131尿巧产量(4.1±0.5邑/1)的3.3倍。
[0024] 发酵培养基(g/L):葡萄糖50,酵母粉5,玉米浆20,硝酸钢15,憐酸二氨钟1，憐酸氨 二钟5.2,硫酸儀5,硫酸锭5,巧樣酸钢10,谷氨酸钢10,氯化巧1，硫酸儘0.02,硫酸锋0.02， pH 6.7~7.0，玉米浆单独灭菌，巧盐单独灭菌，儀儘锋盐配成混合溶液一起灭菌，葡萄糖配 成80 %溶液单独灭菌，其余组分一起灭菌，灭菌条件玉米浆为0.1M化，20min，其余为 0.075MPa，15min。
[00巧]有益效果：
[0026] 1、本发明提供了一株生产喀晚核巧的枯草芽抱杆菌突变株和一个氨甲酯憐酸合 成酶的编码基因，明确了一个与氨甲酯憐酸合成酶受终产物反馈抑制相关的关键调控位 点，可W为W后喀晚核巧高产菌株的选育提供参考。
[0027] 2、本发明提供了一株生产喀晚核巧的枯草芽抱杆菌突变株，通过发酵法生产核巧 喀晚尿巧产量可达13.5±1邑/1，是出发菌株了0131尿巧产量(4.1±0.5邑/1)的3.3倍。
[0028] 3、本发明所提供的生产喀晚核巧的枯草芽抱杆菌突变株与出发菌株TD131相比， 对不同喀晚核巧结构类似物的耐受性显著提高：2-硫尿喀晚、6-氮杂尿喀晚和5-氣尿喀晚 对TD131的临界100%致死浓度分别为150mg/L、100mg/L和80yg/L;2-硫尿喀晚、6-氮杂尿喀 晚和5-氣尿喀晚对A219的临界100%致死浓度则分别提高到3g/L、3.5g/L和lOOmg/L。对2- 硫尿喀晚的耐受能力提高了大约20倍;对6-氮杂尿喀晚的耐受性分别提高了大约35;对5- 氣尿喀晚的耐受能力提高了大约125倍。
【附图说明】：
[00巧]图1 96微孔板筛选结果
[0030] 图2摇瓶筛选结果
[0031] 图3 5L罐发酵过程中菌体的生长状况
[0032] 图4 5L罐发酵过程中葡萄糖的消耗
[0033] 图5 5L罐发酵过程中尿巧的积累量
【具体实施方式】：
[0034] 实施例1.枯草芽抱杆菌A219的筛选
[0035] 本发明将初始菌株TD131经常压室溫等离子诱变-结构类似物抗性筛选-高通量筛 选-摇瓶复筛，获得菌株A219，具体过程如下：
[0036] 1.出发菌株:B.subtilis TD131
[0037] 2.常压室溫等离子诱变
[0038] (1)菌体培养方法:保菌管接LB平板，Ξ区划线，37Γ培养12h;从平板上挑单菌落 接LB摇管，37 °C，200巧m，培养12h;摇管转接LB摇瓶，接种量为1 %，37 °C，200巧m，培养4-化。
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