一种1,3-1,4-β-葡聚糖酶突变体的制作方法
【技术领域】
[0001 ]本发明设及一种1，3-1，4-β-葡聚糖酶突变体，属于基因工程和酶工程领域。
【背景技术】
[0002] β-葡聚糖是存在于禾本科植物细胞壁的一种非淀粉性多糖。其是由高达上千个β- D-葡萄糖残基通过β-1，3或β-1，4糖巧键线状排列而成，具有很高的分子量。其可W溶解于 水中，形成的溶液黏度很高，运给啤酒行业及饲料行业带来了诸多不利。在啤酒工业的主要 原料麦芽中含有大量β-葡聚糖，在麦汁中β-葡聚糖未能及时降解会导致麦汁黏度过大，造 成过滤困难，延长麦膠过滤时间，降低浸出物含量，对于成品啤酒会影响其非生物稳定性。 在纯生啤酒的生产过程时，过多β-葡聚糖的存在会造成滤膜的膜孔堵塞，导致过滤能力下 降。在饲料行业中，大麦和小麦等饲料中含有大量的β-葡聚糖。无论在人的肠道还是动物的 肠道内都不能将0-葡聚糖直接消化吸收，其必须经过酶降解后才能被利用，且0-葡聚糖会 阻止饲料有效成分在动物肠道中内的吸收，降低了饲料中有效成分的转化率，是一种抗营 养因子。与此同时，β-葡聚糖为微生物特别是致病菌的寄居繁殖提供了丰富的营养，造成大 量有害微生物在动物肠道内繁殖，引起畜禽腹泻，同时会竞争性消耗大量物质而降低饲料 利用率。
[0003] 来源于特基拉芽抱杆菌(Bacillus terquilensis)CGX 5-1的1,3-1,4-β-葡聚糖 酶，简称β-葡聚糖酶。1,3-1，4-β-葡聚糖酶可W在3-0-化喃葡萄糖位点专一性切割β-葡聚 糖，最终产物为Ξ糖和四糖。然而，现有的β-葡聚糖酶的热稳定性并不满足目前的工业应 用。在啤酒行业麦汁糖化过程中溫度是从48°C提高至78°C，而饲料行业中烘赔的溫度也在 65°CW上。而目前筛选得到的大部分野生1，3-1，4-β-葡聚糖酶的最适溫度主要集中在45°C 和55°C，而催化活性不高也是其不能推广使用的重要原因。而目前市场上几家酶制剂公司 如诺维信、DMS研发生产的β-葡聚糖酶制剂价格昂贵，而目前国内也有部分酶制剂公司生产 0-葡聚糖酶制剂，但其水平远不及国外酶制剂公司，且0-葡聚糖酶制剂的生产菌种及工艺 都是商业机密，国内研发速率缓慢，因此国内市场在很大程度上依然依赖进口。因此，如果 能够提高野生型1，3-1，4-β-葡聚糖酶的催化活性及热稳定性，获得高活性高热稳定的β-葡 聚糖酶，那么就可W降低成本，推广其在工业上的应用。
[0004] 为了提高1，3-1，4-β-葡聚糖酶的热稳定性，国内外已经对其已经进行了一系列研 究。对β-葡聚糖酶的杂交结果显示，将浸麻芽抱杆菌(B.macerans)来源的前16个氨基酸替 换为淀粉液化芽抱杆菌(B.amyloliquefaciens)来源的前16个氨基酸得到的杂交酶H(A16- M)和两者之间前12个氨基酸进行替换及删除TYR13形成的杂交酶H(A12-M)-Δ13在高溫下 有很好的稳定性。GLN1、Τ皿2、SER5和P肥7位点的突变大幅度的降低了 β-葡聚糖酶的热稳定 性。运说明β-葡聚糖酶的Ν端对于该酶的热稳定性有重要的影响。而巧离子对于在高溫下维 持β-葡聚糖酶的稳定性也有重要作用。针对β-葡聚糖酶中多个赖氨酸进行定点突变研究发 现当其中3个赖氨酸突变为丝氨酸得到的Ξ突变酶(BglTM)的热稳定性和催化活力都有了 一定程度的提升。在β-葡聚糖酶Ξ维结构中添加 N31C-T187C和P102C-N125C两个二硫键也 提高了 e-葡聚糖酶的热稳定性。但是目前得到的改造酶Bg 口 Μ的热稳定性依旧不能适应工 业应用。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是提供一种1，3-1，4-β-葡聚糖酶突变体，尤其是一种具有更高热稳 定性的1，3-1，4-β-葡聚糖酶突变体。
[0006] 所述1，3-1，4-β-葡聚糖酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID N0.USEQ ID N0.2、SEQ 10側.3、569 10側.4、沈9 10側.5、沈9 10側.6或沈9 10側.7所示。分别是54(^、5436、 E46P、肥 05P、E46P/S43E、E46P/S43E/H205P、E46P/S43E/H205P/S40E。
[0007] 所述S40E，是在亲本BglTM的基础上，将第40位的丝氨酸突变为谷氨酸而得到的。 [000引所述S43E，是在亲本BglTM的基础上，将第43位的丝氨酸突变为谷氨酸而得到的。
[0009] 所述E46P，是在亲本BglTM的基础上，将第46位的谷氨酸突变为脯氨酸而得到的。
[0010] 所述H205P，是在亲本BglTM的基础上，将第205位的组氨酸突变为脯氨酸而得到 的。
[0011] 所述E46P/S43E，是在突变体E46P的基础上，将第43位的丝氨酸突变为谷氨酸而得 到的。
[0012] 所述E46P/S43E/H205P，是在突变体E46P/S43E的基础上，将第205位的组氨酸突变 为脯氨酸而得到的。
[0013] 所述E46P/S43E/H205P/S40E，是在突变体E46P/S43E/H205P的基础上，将第40位的 丝氨酸突变为谷氨酸而得到的。
[0014] 本发明还要求保护含有编码所述突变体的基因的载体，W及表达所述突变体的基 因工程菌。
[0015] 所述基因工程菌，在本发明的一种实施方式中，W祀T28a( + )质粒为表达载体，W 大肠杆菌为表达宿主。
[0016] 所述宿主，在本发明的一种实施方式中，为大肠杆菌化21 (DE3)。
[0017] 本发明还提供了一种所述基因工程菌的构建方法。
[0018] 本发明还要求保护所述突变体在食品、饲料领域的应用。
[0019] 本发明的突变体命名，是W亲本氨基酸序列为基准，采用"原始氨基酸位置替换的 氨基酸"来表示突变体。比如S40E代表将位置40的氨基酸由亲本的丝氨酸S替换为谷氨酸E， 又比如E46P/S43E/肥05P/S40E代表第46位、第43位、第205位和第40位的氨基酸同时发生了 突变，分别从谷氨酸、丝氨酸、组氨酸和丝氨酸突变为脯氨酸、谷氨酸、脯氨酸和谷氨酸。
[0020] 本发明的有益效果:本发明提供的几株β-葡聚糖酶突变体，与野生酶相比，其热稳 定性有了大幅度提升。突变体 S40E、S43E、E46P、ffi05P、E46P/S43E、E46P/S43E/ffi05P、E46P/ S43E/H205P/S40E在70°C溫浴1小时后剩余酶活力分别为14.8%、21.3%、26.7%、17.9%、 % . 3 %、46.9 %和59.4%，而野生酶经过同样处理后剩余酶活仅为6.3 % (图1)。突变体 E46P/S43E/H205P/S40E的最适溫度和T5Q值分别为65°C和79.5°C，和野生酶相比分别提高了 5°C和3.5°C。其在60°C和70°C下的半衰期分别达到126.4分钟和80.4分钟，分别是野生酶的 2.14倍和2.89倍。突变体E46P/^S43E/H205P/S40E的最适pH为pH6.0，和野生酶相比降低了 0.5个抑，而突变体的催化性质和野生酶几乎相同。本发明的突变体，在保证催化活性的同 时使得e-葡聚糖酶的热稳定性有所提高，更有利于在工业上的应用。
【附图说明】
[0021] 图1:野生酶与7株β-葡聚糖酶突变体在70°C下处理1小时剩余酶活比较
[0022] 图2:野生酶与β-葡聚糖酶突变体E46P/S43E/肥05P/S40E的最适溫度曲线
[0023] 图3:野生酶与β-葡聚糖酶突变体E46P/S43E/肥05P/S40E在60°C的半衰期比较
[0024] 图4:野生酶与β-葡聚糖酶突变体E46P/S43E/肥05P/S40E在70°C的半衰期比较 [00巧]图5:野生酶与β-葡聚糖酶突变体E46P/S43E/肥05P/S40E的T50值曲线比较
【具体实施方式】
[0026] 实施例1β-葡聚糖酶的迭代饱和突变
[0027] 在40、43、46和205四个位点进行迭代饱和突变并测定了突变体的热稳定性参数。 W质粒祀T28a( + )-BglTM(Niu C，Zhu L，Zhu Ρ,Li Q.2015丄ysine-Based Site-Directed Mutagenesis Increased RigidP-Sheet Structure and Thermostability ofMesophilic 1,3-1,4-0-Glucanase.Journal ofAgri州Itural and Food Chemistry 63:5249-5256)为 模板，在40位、43位、46位和205位通过Qui ckchange的方法引入NNK简并密码子(N: Ade/切t/ Gua/Thy;K:Gua/Thy)来替代目的氨基酸。
[0028] 在40位引入NNK简并密码子的定点突变引物为：
[00巧]正向引物：5'-cgtggcgggctaataacgtaNNKatgacgtcattgggtgaaatgc-3'，大写字母 为突变碱基，
[0030]反向引物：5 '-gcatttcacccaatgacgtcatMNNtacgttattagcccgccacg-3 '，大写字母 为突变碱基；
[0031 ]在43位引入NNK简并密码子的定点突变引物为：
[0032] jES 引串勿：5 ' 一邑ctaataac邑tatcaat邑ac邑NNKtt邑邑邑t邑aaat邑C邑ttta邑C邑ctaa-3 '， 字母为突变碱基，
[0033] 反向引物：5 '-ttagcgctaaacgcatttcacccaaMNNcgtcattga1:acgttat1:agc-3'，大写 字母为突变碱基；
[0034] 在46位引入NNK简并密码子的定点突变引物为：
[00：35]正向引物：5 '-gtatcaatgacgtcattgggtNNKatgcgtt1:agcgctaacaagc-3 '，大写字母 为突变碱基，
[0036] 反向引物：5 '-gcttgttagcgc1:aaacgcatMNNacccaatgacgtcattgatac-3 '，大写字母 为突变碱基；
[0037] 在205位引入NNK简并密码子的定点突变引物为：
[0038] 正向引物：5 ' -ggtgtaaatccgctatacgctNNKtatgactgggtgcgctatacaa-3 '，大写字 母为突变碱基，
[0039] 反向引物：5 ' -ttgtatagcgcacccagtca1:aMNNagcgtatagcggatttacacc-3 '，大写字 母为突变碱基；
[0040] 如ickchange法重叠延伸PCR具体实施条件如下：
[0041 ] PCR反应体系均为：2XI%an化Max Buffer 2扣L，dNTP Mix化L，10yM正向引物化 L，ΙΟμΜ反向引物化L，模板DM化L，P虹anta?Max聚合酶化L，双蒸水补齐至50化；
[0042] PCR反应扩增条件:94°C预变性5min;随后进行94°C Imin，56 °C 50s，72 °C 50s 30个 循环;最后保存在4°C。
[0043] 在上述通过PCR扩增得到的