基于乳液pcr的大片段单分子簇扩增技术的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物化学领域，具体的，设及一种基于乳液PCR的大片段单分子簇扩增 技术。
【背景技术】
[0002] PCR技术是通过酶促反应体外合成DNA片段的方法，能够迅速获得所需片段，具有 操作简便、灵敏度高、特异性强等特点。PCR技术已经被应用于多个领域，如基因表达分析、 核酸序列分析W及当前的疾病诊断等。在PCR技术基础上衍生出各种分支技术，乳液PCR技 术就是其中之一，乳液PCR主要是通过将PCR反应所有成分注入快速旋转的油相表面，从而 在一个反应体系中形成数目庞大的微反应器，使得每个微反应器中有少量的模板，从而减 少模板间、引物间的相互干扰，最大化试剂的利用率，提高PCR反应的特异性。其应用领域也 是相当广泛，包括可W辅助形成高通量测序过程中的单分子簇、使多重PCR中每种PCR产物 相对均衡等。虽然该技术的优势明显、应用广泛，但由于其仅适用于较短的扩增长度，所W 限制了其在更多方面的应用。虽然目前用于长片段扩增的DNA聚合酶已经很多，扩增的最长 片段达到几十肺P，但是实际扩增过程中的情况却是常常难W获得理想的扩增效果，得到的 扩增条带也经常有非特异带甚至弥散带，所W不能满足大片段扩增的需求。
[0003] 因此有必要对乳液PCR技术进行优化，增加乳液PCR技术的扩增长度，扩展乳液PCR 的应用范围，从而为进一步拓展乳液PCR技术的应用领域提供有效手段。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的在于解决现有的乳液PCR技术所存在的难W扩增获得特异性长片段 的缺陷，发明一种新的大片段单分子簇扩增方法。
[0005] 为此，本发明提供了一种基于乳液PCR技术的大片段单分子簇扩增方法，所述方法 包括:将携带有生物素标记的PCR引物与磁珠进行结合解育，使引物吸附于磁珠表面形成引 物簇，利用所述引物簇进行乳液PCR反应。
[0006] 本发明中对于PCR引物进行生物素标记的方法没有特别的限制，可W利用本领域 常规的标记方法进行。
[0007] 可选的，所述磁珠为T1磁珠或M270磁珠。
[000引在本发明的一种优选的实施方式中，所述PCR引物的核巧酸序列如SEQ ID NO.3所 /J、- 0
[0009] 可选的，结合解育的体系为： 磁珠 lOOug 2 X磁珠结合缓冲液 25ul
[0010] 携带有生物素标记的PC民引物 5-10 umol ddH.O 加水至总体系为50ul。
[0011] 可选的，所述结合解育的条件为将所述携带有生物素标记的PCR引物与磁珠在20- 25°C解育5-20min。清洗磁珠4-5次，清洗的方法为用1 XBeads Wash Buffer清洗两次， d地2〇洗2-3次。
[0012] 在本发明所提供的方法中，乳液PCR反应体系由预先各自配制好的水相和油相混 合制成。在所述乳液PCR反应体系中，包括引物簇W及游离引物，所述游离引物不带有生物 素标记，游离引物的核巧酸序列与引物簇中磁珠上所吸附的PCR引物相同。游离引物的作用 为增加微反应体系中单分子模板的数量，模板数量的增多会增大模板与磁珠上引物的碰撞 几率，使得扩增反应更容易发生。
[0013] 可选的，乳液PCR反应体系的水相包括： 2 X PC反缓冲液 25ul
[0014] dNTPs 04mM 每种 DNA 聚合酶 0.5-lU/50ui 引物簇 50-K)0ug
[001引游离PC民剖物 0.15-OJuM每棘 模板 DNA 0.1-200ng^0ul ddHsO 蛋水猶体系慧量为彿ul。
[0016] 在本发明所提供的方法中，所述游离PCR引物为未经过生物素标记的PCR引物。
[0017] 本发明所提供的方法还包括预先对基因组DNA进行破碎获得5-8肺P的大片段，利 用所述大片段进行文库构建获得大片段文库作为模板DNA。
[0018] 本发明中，对于文库构建的方式没特别的限制，可W按照本领域常规的方法进行 构建。
[0019] 在本发明的一种优选的实施方式中，可W按照W下步骤构建大片段文库:将超声 破碎后的大片段用AMPure beads进行纯化，试剂盒进行大片段文库构建，经过末端修复加 A 尾后，加接头，接头序列优选如SEQ ID NO. 1-2所示。用0.6%琼脂糖凝胶电泳分离核酸片 段，切取4肺P、5肺P或6肺P附近的片段，用试剂盒回收目的片段获得大片段文库。
[0020] 可选的，乳液PCR反应的条件包括:94°C预变性Imin; 98 °C变性lOsec，68 °C退火延 伸4min，15-25个循环;72°C延伸5min;可根据实际需求选择具体循环数。
[0021] 优选的，为了获得更好的扩增效果，增加产物量、减少非特异性带和弥散带的产 生，在扩增过程中，升溫速度为1.0-1.5°C/s，降溫速度为1.5-2.4°C/s。
[0022] 特别优选的，升溫速率为1 .(TC/S，降溫速率为1.5°C/S。
[0023] 可选的，乳液PCR反应所使用的DM聚合酶为ΚΑΡΑ、肥B或K0D。
[0024] 可选的，为了获得更好的扩增效果，减少非特异性带和弥散带的产生，乳液PCR反 应所使用的DNA聚合酶为K0D。
[0025] 可选的，在每lOOul PCR反应体系的水相中加入321.6ul油，满旋震荡形成乳液PCR 体系;满旋混匀仪最大转速震荡5-7分钟，每50ul-管进行PCR反应。
[00%] 可选的，利用超声破碎的方式对基因组DNA进行破碎，超声破碎的条件包括:在20- 4化赫兹下超声破碎10-30S。
[0027]可选的，所述方法还包括利用与乳液PCR反应体系等体积的二下醇或异丙醇进行 破乳，破乳的条件为W1000-5000转/分钟的速度离屯、4-6分钟，回收磁珠。
[00%]本发明中，油相可W按照W下方式进行配制:使用life science公司的油相，按照 Stabilizer l:Stabilizer 2:Mineral oil = 75:4:920或9:2:189的比例进行油相配制。
[0029] 本发明利用长片段核酸扩增酶，结合乳液PCR技术，制备单分子大片段簇，可W保 证一个磁珠上携带多个同样的大分子，在用于基因组文库构建时能够确保同样index对应 的大片段在打断后有overlap,确保大片段的有效组装，从而协助基因组组装。目前已成功 达到4-6Kbp，并且二次PCR检测主带清晰，可W作为基因组文库构建新技术的储备技术。
【附图说明】
[0030] 图1为本发明实施例1的琼脂糖凝胶电泳图，其中Μ为1Kb marker，1为二次PCR结 果。
[0031] 图2为本发明实施例2的琼脂糖凝胶电泳图，其中左边起第一条泳道为1Kb marker，第二和Ξ泳道分别为W〇. 25ug和0.加 g磁珠为模板的二次PCR结果。
【具体实施方式】
[0032] 下面结合【具体实施方式】对本发明进行详细说明。
[0033] W下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例 中所用技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。
[0034] 实施例1
[0035] 1、大片段核酸文库的制备
[0036] 取lug水稻基因组DNA，进行大片段核酸文库制备：
[0037] (1)水稻基因组DNA经10s超声破碎，获得5-8Kbp的大片段，用AM化re XP Beads (邸CMAN，A63880)纯化；纯化后的样品加入VAHTS Turbo End Prep En巧me Mix和VAHTS Turbo End Prep Reaction Buffer,混匀后20°C反应30min、65°C反应30min;
[0038] (2)反应结束后加入 VAHTS Turbo T4 DNA Ligase、VAHTS Turbo Ligase Enhancer、加入接头，混匀后20 °C反应15min，磁珠纯化；
[0039] 接头序列如沈Q ID NO. 1-2所示。
[0040] 沈Q ID NO.1:5'-TGAGTGCCTTCTGCGTCCAGTCT-3';
[0041] 沈Q ID N0.2:5'-P03-GACTGGACGCAGAAGGCACTCA-3\
[0042] (3)纯化后的样品，经0.6%琼脂糖凝胶进行片段分离，切取5肺p下边缘至服bp下 边缘的胶块，回收DNA片段。
[0043] (4)检测大片段文库如bit浓度为1.44ng/ul。
[0044] 2、引物簇制备
[0045] (1)取M270磁珠，与含生物素标记的引物解育，形成引物簇，体系如下： 磁珠 lOOug; 2 X磁珠结合缓冲液 25ul;
[0046] 携带有生