供植物中基因靶向用的工程化降落场的制作方法
【专利说明】供植物中基因卽向用的工程化降落场
[0001] 本发明申请是基于申请日为2011年1月21日，申请号为201180015548.8(国际申请 号为PCT/US2011/022145)，名称为"供植物中基因祀向用的工程化降落场"的发明专利申请 的分案申请。
[0002] 优先权要求
[0003] 本申请要求2010年1月22日提交的美国临时专利申请流水号61/297,641关于 巧NGI肥邸邸 LANDING PADS FOR GE肥 TARGETING IN PLANTS"的提交日的权益。 发明领域
[0004] -般地，本发明设及用于生成转基因生物体，例如植物的组合物和方法。在某些实 施方案中，本发明的方法容许将工程化降落场(engineered landing pad,化P)渗入基因组 位点中，由此便于将其它感兴趣的核酸分子导入含有一个或多个化P的限定基因组位点中。 在一些实施方案中，ELP可W包含含有在锋指核酸酶(ZFN)结合位点侧翼的基本上随机的序 列的核巧酸序列区。
[0005] 发明背景
[0006] 许多植物用来自其它物种的基因遗传转化W导入期望的性状，诸如W经由例如改 善营养价值质量、提高产量、赋予有害物或疾病抗性、提高干旱和应激耐受性、改善园艺质 量诸如色素沉着和生长、和/或赋予除草剂抗性;实现自植物生成工业上有用的化合物和/ 或材料;和/或实现药物的生成来改善农业价值。克隆基因对植物细胞的导入和稳定的能育 转基因植物的回收可W用于进行植物的此类修饰，并且已经容许植物的遗传工程(例如用 于作物改良）。在运些方法中，通常将外来DNA随机导入真核植物细胞的核或质体DNA中，接 着分离含有整合入细胞的DNA中的外来DNA的细胞，W生成经稳定转化的植物细胞。
[0007] 第一代转基因植物通常通过±壤杆菌属(Agrobacterium)介导的转化技术生成。 用运些技术获得的成功激励开发将感兴趣的核酸分子导入植物基因组中的其它方法，诸如 原生质体中阳G介导的DNA摄取、微粒轰击、和娃须晶(wh i S ker)介导的转化。
[000引然而，在所有运些植物转化方法中，渗入植物基因组中的转基因 W随机方式且W 不可预测的拷贝数整合。通常，转基因可整个转基因或其部分的重复形式整合。此类复 杂的整合样式可W影响转基因的表达水平(例如，通过经由转录后基因沉默机制破坏转录 的RNA，或者通过诱导对导入DNA的甲基化实现），由此下调转基因的转录。还有，整合位点本 身可W影响转基因的表达水平。运些因素的组合导致感兴趣的转基因或外来DNA在不同转 基因植物细胞和植物系间的表达水平的广泛变化。此外，感兴趣的外来DNA的整合可W对基 因组中发生整合的区域具有破坏性影响，而且可W影响或扰乱所述祀区域的正常功能，由 此经常导致不想要的副作用。
[0009] W上需要无论何时调查将特定外来DNA导入植物中的影响，生成并分析大量转基 因植物系W获得显著的结果。同样地，在转基因作物植物的世代中，在植物中导入感兴趣的 特定DNAW提供具有期望表型的转基因植物的情况中，创建独立创建的转基因植物系的大 群体W容许选择具有最佳转基因表达，且对转基因植物的总体表型具有最小或无副作用的 那些植物系。特别在此领域中，例如鉴于繁琐的管理要求和与消除不想要的转基因事件需 要的重复田间试验有关的高成本，更定向的转基因方法是期望的。此外，会清楚的是，祀向 性DNA插入的可能性在转基因叠加过程中也会是有益的。
[0010] 已开发出几种方法W控制植物中的转基因插入。见例如Kumar和Fladung(2001) 化ends Plant Sci.6:155-9。运些方法依赖于基于同源重组的转基因整合。此策略已经在 原核生物和低等真核生物中成功应用。Paszkowski等（1988化MB0 J.7:4021-6。然而，对于 植物，直到最近，转基因整合的主要机制基于非常规重组，其牵设重组DNA链间很少的同源 性。因此，此领域中的主要挑战是检测罕见的同源重组事件，其被经由非常规重组有效得多 地整合导入的外来DNA掩盖。
[0011] 定制设计的锋指核酸酶(ZFN)是为了提供DNA中祀定位点特异性双链断裂，随后重 组切割末端设计的蛋白质。ZFN组合限制性内切核酸酶，诸如例如化kl的非特异性切割域与 锋指 DNA 结合蛋白。见例如Huang等（1996) J. Protein Chem. 15 :481-9 ;Kim等（1997) Proc.化tl.Acad.Sci.USA 94:3616-20;Kim等（1996)Proc.化tl.Acad.Sci.USA 93:1156- 60;Kim等（1994)Proc Natl.Acad.Sci.USA 91:883-7;Kim等（1997b) Proc.化tl.Acad.Sci.USA 94:12875-9;Kim等（1997c)Gene 203:43-9;Kim等（1998) Biol.Chem.379:489-95;Nahon和Raveh(1998)Nucleic Acids Res .26:1233-9;Smith等 (1999)Nucleic Acids Res.27:674-81。各个锋指基序可W设计为祀向并结合大范围的DNA 位点。规范的切S2化S2及非规范的切S3化S锋指蛋白通过将α-螺旋插入双螺旋的大沟中结合 DNA。锋指对DNA的识别是模块的：每个指主要接触祀物中的立个连续的碱基对，并且蛋白质 中的几个关键残基介导识别。已经显示了化kl限制性内切核酸酶必须经由核酸酶域二聚化 W切割DNA，诱导双链断裂。类似地，Ζ?^也需要核酸酶域的二聚化W切割DNAnMani等(2005) Biochem.Biophys.Res.Commun.334:1191-7;Smith等（2000)Nucleic Acids Res.28:3361- 9"ZFN的二聚化由两个相邻的、相反取向的结合位点促进。同上文。
[0012] 发明概述
[0013] 本文中公开了将核酸分子导入展现出低同源重组率的宿主生物体，例如，植物或 动物物种的基因组中的方法。在具体的例子中，使用"工程化降落场"巧LP)，其中ELP可W包 含如下的核巧酸序列区，其包含在DNA结合域(例如，锋指蛋白（ZFP)、大范围核酸酶、或亮氨 酸拉链)的结合位点侧翼的与宿主生物体的基因组基本上缺乏同源性的核巧酸序列(例如， 随机生成的序列）。祀向ELP的结合位点的DNA结合域可W天然地包含DNA切割功能域或者可 W是融合蛋白中进一步包含功能域，例如内切核酸酶切割域或切割半域(例如，ZFN、重组 酶、转座酶、或归巢内切核酸酶，包括具有经修饰的DNA结合域的归巢内切核酸酶）的部分。 此类DNA结合和切割蛋白在本文中统称为"祀向性内切核酸酶"。在具体的例子中，也可W使 用来自与宿主生物体不同的生物来源的非随机化核巧酸序列；与祀生物体的基因组的非同 源性是合适的。如此，在一些例子中，核巧酸序列可W设计为确保与任何测序的祀植物基因 组的区域基本上没有同源性。
[0014] 在一些例子中，ELP可W提供同源性区和祀向性内切核酸酶(例如，ZFN)的高活性 的结合位点W进行同源性指导的基因祀向。因此，ELP可W降低或消除对在核酸插入物中使 用外部或内部的其它核巧酸序列的需要。ELP可W设计为缺乏任何假的可读框，而且如优选 的，含有或缺乏限制酶位点W构建载体或分析用感兴趣的核酸分子转化的植物。在一些例 子中，ELP侧翼可W有不同限制性位点，其在限制酶消化后生成相容的末端，但是杂合的连 接位点是任一种限制酶不可切割的。在运些和其它例子中，运容许将化P串联成更大的排列 (array )，它们各具有独特的同源性区和祀向性内切核酸酶结合位点(例如，ZFN结合位点）。
[0015] 在一些例子中，ELP可W随机渗入祀基因组中，或者祀向至已经显示容纳转基因插 入物的基因组位点，而对所得的转基因植物没有任何，或者具有可接受的有害影响。基因组 祀位点中的同源性区可W与祀定的供体核酸分子中的同源性区相同，由此便于祀向性内切 核酸酶(例如，ZFN)的双链切割后同源性指导的重组。
[0016] 因而，公开了设计并生成化P的方法W及使用ELP用感兴趣的核酸分子转化植物的 方法。还公开了可用于本发明的核酸分子，和通过依照本发明的方法生成的经遗传修饰的 植物。
[0017] 具体地，本发明设及如下各项：
[0018] 1. -种用于生成转基因植物或植物组织的方法，该方法包括：
[0019] 提供核酸分子，该核酸分子包含与植物细胞的基因组DNA基本上缺乏序列同源性 的至少两个核酸序列区和至少一个祀向性内切核酸酶识别位点，其中与所述植物细胞的基 因组DNA缺乏基本的性序列同源性的所述至少两个核酸序列区在所述至少一个祀向性内切 核酸酶识别位点侧翼；
[0020] 用所述核酸分子转化所述植物细胞或包含所述植物细胞的植物组织，其中所述核 酸分子稳定整合入所述植物细胞的基因组中；并
[0021 ]自用所述核酸分子转化的所述植物细胞生成植物组织或再生植物。
[0022] 2.项1的方法，其中所述核酸分子进一步包含不同限制性位点。
[0023] 3.项2的方法，其中所述不同限制性位点包含相容的单链末端，其容许多个ELP的 连环化。
[0024] 4.项1的方法，其中与所述植物细胞的基因组DNA缺乏序列同源性的所述至少两个 核酸序列区不包含可读框。
[0025] 5.项1的方法，其中与所述植物细胞的基因组DNA缺乏序列同源性的所述至少一个 核酸序列区不包含可读框。
[00%] 6.项1的方法，其中与所述植物细胞的基因组DNA缺乏序列同源性的所述至少两个 核酸序列区是约50bp至约3化。
[0027] 7.项1的方法，其中与所述植物细胞的基因组DNA缺乏序列同源性的所述至少两个 核酸序列区选自下组中的一种或多种:序列ID NO 1到10。
[00%] 8.项1的方法，其中与所述植物细胞的基因组DM缺乏序列同源性的所述至少两个 核酸序列区和祀向性内切核酸酶包含序列ID 15和16。
[0029] 9.项1的方法，其中与所述植物细胞的基因组DNA缺乏序列同源性的所述至少两个 核酸序列区和祀向性内切核酸酶包含并入用于转化单子叶植物、双子叶植物，包括芸苔的 植物转化载体9048104137、9048104139、9048104141、或9048104143中的序列10 15和16。
[0030] 10.依照项1的方法，其中所述祀向性内切核酸酶是锋指核酸酶。
[0031] 11.项1的方法，其中所述核酸分子在所述植物细胞的基因组中稳定地随机整合。
[0032] 12.项1的方法，其中所述核酸分子在所述植物细胞的基因组中在一个或多个已知 祀位点处稳定整合。
[0033] 13.项1的方法，其中所述核酸分子稳定整合入染色体或微型染色体的扩增区中。
[0034] 14.通过项1的方法生成的转基因植物组织或植物。
[00巧]15.由项14的转基因植物生成的种子。
[0036] 16.-种用于生成转基因植物的方法，该方法包括：
[0037] 提供自项8的转基因植物组织或植物分离的细胞或组织；
[0038] 提供至少一种祀向性内切核酸酶或包含编码所述至少一种祀向性内切核酸酶的 核酸序列的第一核酸分子，其中所述至少一种祀向性内切核酸酶识别导入所述转基因植物 的基因组中的至少一个祀向性内切核酸酶识别位点；
[0039] 提供第二核酸分子，其包含感兴趣的核酸序列和在所述感兴趣的核酸序列侧翼的 两个额外的核酸序列，其中所述两个额外的核酸序列各与同基因组DNA缺乏序列同源性的 两个核酸序列区之一同源；
[0040] 将（i)所述至少一种祀向性内切核酸酶或所述第一核酸分子;和（ii)所述第二核 酸分子导入所述植物细胞或组织中，其中所述感兴趣的核酸序列稳定整合入所述植物细胞 的基因组中；并
[0041 ]自用所述第一和第二核酸分子转化的植物细胞或组织再生植物。
[0042] 17.通过项16的方法生成的转基因植物。
[0043] 18.由项17的转基因植物生成的种子。
[0044] 19.项1的方法，其中所述核酸分子在每个末端侧翼有一个或多个额外的祀向性内 切核酸酶识别位点。
[0045] 20.项19的方法，其进一步包括将识别所述一个或多个额外的祀向性内切核酸酶 识别位点的一种或多种祀向性内切核酸酶导入所述植物组织或植物中，其中自所述植物组 织或植物的基因组切除所述核酸分子。
[0046] 21.依照项16的方法，其中所述祀向性内切核酸酶是锋指核酸酶。
[0047] 从参照附图进行的几个实施方案的W下详细描述看，上述和其它特征会变得更加 显而易见。
[004引附图简述
[0049]图1包括包含ELP的代表性载体pDAB 100610的描绘。
[0化0]图2包括包含ELP的代表性载体PDAB100611的描绘。
[0化1 ]图3包括包含ELP的代表性载体PDAB100640的描绘。
[0化2]图4包括包含ELP的代表性载体PDAB100641的描绘。
[0053] 图5包括包含要整合入ELP中的供体片段的代表性载体PDAB105955的描绘。
[0054] 图6包括包含要整合入ELP中的供体片段的代表性载体PDAB105956的描绘。
[0055] 图7包括包含要整合入ELP中的供体片段的代表性载体PDAB105979的描绘。
[0056] 图8包括包含要整合入ELP中的供体片段的代表性载体PDAB105980的描绘。
[0057] 图9是a)玉米中的化P l;b)用于化P1再祀向的供体构建体;C)再祀定的化P1基因 座的不意图。
[0化引图10包括代表性载体PDAB104132的描绘。
[0059]图11包括侧翼有工程化锋指结合位点和缓冲序列(buffer sequence)的多克隆位 点的代表性DNA片段的描绘。
[0060]图12包括代表性载体pDAB 104126的描绘。
[0061 ]图13包括代表性载体pDAB 104136的描绘。
[0062] 图14包括代表性载体pDAB 104138的描绘。
[0063] 图15包括代表性载体pDAB 104140的描绘。
[0064] 图16包括代表性载体PDAB104142的描绘。
[00化]图17包括代表性载体PDAB104133的描绘。
[0066] 图18包括代表性载体PDAB104134的描绘。
[0067] 图19包括代表性载体PDAB104135的描绘。
[006引图20包括代表性载体PDAB104137的描绘。
[0069] 图21包括代表性载体pDAB 104139的描绘。
[0070] 图22包括代表性载体PDAB104141的描绘。
[0071] 图23包括代表性载体PDAB104143的描绘。
[0072] 发明详述
[0073] I.几个实施方案的概述
[0074] 在一些实施方案中，提供了用于将包含"工程化降落场"化LP)的核酸分子导入宿 主生物体中，从而便于其它感兴趣的核酸分子整合入宿主生物体中的方法。在实施方案中， ELP可W包含在祀向性内切核酸酶识别位点（例如，ZFN识别位点）侧翼的与宿主生物体的天 然序列不同源的核酸序列区（例如，基本上随机生成的核酸序列，然后，其可W基于某些期 望的标准为了插入而选择，如本文中公开的）