水稻OsCSA基因的应用及其定点敲除方法
【技术领域】
[0001 ]本发明属于水稻育种技术领域，设及水稻OsCSA基因的应用及其定点敲除方法，具 体地，设及一种基于CRISPR/Cas9系统的水稻雄性不育基因 CSA定点敲除方法及利用该方法 在不同水稻品种中的创制雄性不育系的应用。
【背景技术】
[0002] 雄性不育系为水稻杂交制种技术提供关键的育种材料，在全世界范围内展开了广 泛的研究。水稻花粉碳饥饿(Carbon Starved Anther,csa)基因编码一个参与水稻花药发 育和糖分配调控的R2R3MYB转录因子，主要在花药绒拉层细胞和糖转运维管组织中表达 (Zhang et al，2010KCSA基因的突变会造成水稻光敏雄性不育，表现出在短光照下雄性不 育、长日照下恢复可育的特征;此外，csa不育系和恢复系肝69杂交产生的F1代具有杂种优 势(Zhang et al,2013)，因此，基于csa的光敏雄性不育系，可用于水稻两系杂交稻制种，应 用前景广阔。
[0003] CRISPR/Cas9(成簇、规律间隔短回文重复序列及相关蛋白）系统是近几年出现的 基因组编辑新技术，在各种生物和细胞等领域都有广泛的研究和应用。CRISPR/tas9系统是 一种源于原核生物抵御隧菌体、质粒等入侵长期进化的获得性免疫系统，其在指导RNA下完 成对外源遗传物质的降解。CRISPR/Cas9系统的化s9蛋白与sgRNA形成复合体，切割与sgRNA 上spacer互补的基因组DNA序列，产生DNA双链断裂(DSB)，激活细胞启动DM损伤修复机制， 通过非同源末端连接(NHEJ)或同源重组化R)方式引入突变。与锋指核酸酶(ZFNs)和转录激 活子样效应因子核酸酶(TALENs)相比，CRISPR/tas9系统技术具有设计简单、构建快速、突 变效率高、多把点同时编辑等优势。
[0004] 目前，水稻雄性不育系的创制主要是通过杂交将不育基因或位点导入其他水稻品 种中，但是转育周期较长、过程较复杂、劳动成本大。通过CRISPR/化s9系统的祀向修饰直接 对水稻CSA基因进行定点突变或敲除，创制基于CSA基因的水稻雄性不育株系，大大缩短育 种周期。
【发明内容】
[0005] 本发明针对现有技术的不足，提供一种水稻OsCSA基因（即水稻雄性不育基因 CAS) 的应用及其定点敲除方法，提供了一种基于CRISPR/化s9系统的水稻雄性不育基因 CSA定点 敲除方法及利用该方法在不同水稻品种中的创制雄性不育系的应用，利用CSA基因及其蛋 白参与水稻花药发育调控的特点及CRISPR/化s9系统的基因组祀向修饰，通过突变CSA基因 核巧酸序列筛选水稻雄性不育株系，在农业生产上具有十分重要的应用。
[0006] 本发明的目的是通过W下技术方案实现的：
[0007] 第一方面，本发明设及一种水稻OsCSA基因的应用，所述OsCSA基因编码的氨基酸 序列如SEQ ID N0.1所示，所述的应用具体是，采用基于CRISPR/化s9系统敲除、改变或抑制 CSA基因，使得常规水稻品种中的CSA基因表达水平降低，进而获得水稻雄性不育株系。
[000引优选地，所述CRISPR/tas9系统为II类CRISPR/tas9载体系统。
[0009] 优选地，所述CRISPR/Cas9载体系统为：基于ps排-Cas9-〇s和PCAMBIA1300载体的 CH-CRISPR/Cas9 构建、基于 pOs-sgRNA 和 pH-Ubi-Cas9 载体的 Gatewa 厂 CRISPR/Cas9 构建中 的一种或两种；
[0010] 所述CRISPR/Cas9载体系统采用的祀序列为CSA序列中任一包括XXXNGG的核酸序 列;其中，XXX为19-20bp的核酸序列，N为4、1\6、(：中的任意一个碱基。
[0011] 优选地，所述常规水稻品种为梗稻品种9522,交源5B，或空育13。
[0012] 第二方面，本发明设及一种基于CRISPR/Cas9系统的水稻OsCSA基因的定点敲除方 法，所述定点敲除方法包括如下步骤：
[0013] a)构建含有水稻OsCSA基因祀序列CSA-1的ps曲-Cas9-〇s表达盒CH-CSA-1质粒；
[0014] b)酶切CH-CSA-1质粒，将含有CSA-1片段的序列构建到PCAMBIA1300质粒中形成 CC-CSA-1 质粒；
[001引C)将含CC-CSA-1质粒的根癌农杆菌转入水稻品种中；
[0016] 其中，所述祀序列CSA-1为位于SEQ ID NO. 2的第49位至第68位的核酸序列；所述 〇：-〔54-1质粒含有如569 10^.3所示的核巧酸序列。
[0017] 第Ξ方面，本发明设及一种基于CRISPR/Cas9系统的水稻OsCSA基因的定点敲除方 法，所述定点敲除方法包括如下步骤：
[0018] a)构建含有水稻OsCSA基因祀序列CSA-1的pOs-sgRNA表达盒sgRNA-CSA-1质粒；
[0019] b)通过gateway克隆将含有CSA-1片段的序列构建到抑-Ubi-Cas9质粒中形成GC- CSA-1质粒；
[0020] C)将含GC-CSA-1质粒的根癌农杆菌转入水稻品种；
[0021] 其中，所述祀序列CSA-1为位于SEQ ID NO. 2的第49位至第68位的核酸序列；所述 6〇〔54-1质粒含有如569 10^.3所示的核巧酸序列。
[0022] 第四方面，本发明设及一种水稻OsCSA基因定点敲除获得水稻雄性不育株系的方 法，所述方法包括如下步骤:取常规水稻品种，采用如权利要求3或4所述的方法进行处理， 之后进行筛选鉴定，进而获得水稻雄性不育株系。
[0023] 采所述定点敲除方法在所述常规水稻品种中表达是通过所述CC-CSA-1质粒将编 码所述CC-CSA-1的基因导入所述常规水稻品种中实现的；所述采用权利要求4所述定点敲 除方法在所述常规水稻品种中表达是通过所述GC-CSA-1质粒将编码所述GC-CSA-1的基因 导入所述常规水稻品种中实现的。
[0024] 优选地，所述筛选为转化植株筛选，具体包括如下步骤:通过CRISPR/Cas9系统载 体自身的通用引物M13F和所述CSA-1祀序列引物的聚合酶链式反应扩增实现的。
[0025] 优选地，所述鉴定为突变植株鉴定，具体包括如下步骤:通过将CSA基因的特异性 引物扩增CSA基因的基因组片段进行测序实现的。
[00%]优选地，所述常规水稻品种为梗稻品种9522,交源5B，或空育13。
[0027]本发明的基于CRI SPR/Cas9系统水稻OsCSA基因定点敲除方法，具体为分别利用基 于 CH-CRISPR/Cas9 系统的 CC-CSA-1 载体和基于 Gatewa 厂 CRISPR/Cas9 系统的 GC-CSA-1 载体 对水稻雄性不育基因 CSA实现定向基因编辑；
[002引所述CC-CSA-1载体为特异性修饰所述水稻OsCSA基因内CSA-1祀序列的CH- 0?15?3/(：曰39系统；所述0：-〔54-1载体的祀序列〔54-1由569 10齡.2序列的第49位至第68 位的核酸序列组成;所述CSA-1祀序列长度为20bp;单独使用所述CC-CSA-1载体可在所述水 稻品种CSA基因内祀序列处引入插入缺失突变，使所述水稻品种CSA基因失去原有的功能； [00巧]所述GC-CSA-1载体为特异性修饰所述水稻OsCSA基因内祀序列的Gateway- 〇?15?3/(：曰39系统；所述6(：-〔54-1载体的祀序列〔54-1由569 10齡.2序列的第49位至第68 位的核酸序列组成;所述CSA-1祀序列长度为20bp;单独使用所述GC-CSA-1载体可在所述水 稻品种CSA基因内祀序列处引入插入缺失突变，使所述水稻品种CSA基因失去原有的功能。
[0030] 实验证明，单独使用CC-CSA-1导入所述水稻品种中获得的CSA基因突变植株的突 变率16.7 % ;单独使用GC-CSA-1导入所述水稻品种中获得的CSA基因突变植