一种转人神经生长因子基因的小鼠及其制备方法和应用
【技术领域】
[0001] 本发明设及通过转基因方法获得的动物及其制备方法和应用，特别设及一种转人 神经生长因子基因的小鼠及其制备方法和应用。
【背景技术】
[0002] 神经生长因子（即Nerve Growth Factor,简称NGF)是神经营养素家族的第一位成 员，它由Cohen和Levi-Mon化Icini在1954年发现,并在随后的研究中阐明了其功能。Cohen 和Levi-Montalcini因此获得了 1986年的诺贝尔医学或生理奖。NGF不但对神经细胞的增殖 和分化有重要作用，还对非神经细胞，例如免疫细胞、成纤维细胞、膜腺细胞和屯、肌细胞等 的生长和活性都有重要功能。因此，NGF对神经性和非神经性疾病都有良好的潜在治疗作 用。
[0003] 因为鼠神经生长因子即鼠源NGF(mouse NGF，mNGF)和人神经生长因子即人源NGF 化uman NGF，hNGF)在氨基酸序列上有85 %的同源性，并且许多研究已经报道鼠源NGF对治 疗各种神经损伤或退化疾病有明显的效果，从雄性小鼠的颂下腺纯化而来的鼠源NGF在 2003年已被中国药监局批准用于治疗人神经损伤和退化相关疾病。目前，在中国药品市场 上，鼠源NGF的价格约为1000元/毫克，2015年的销售总量约为5百万毫克，产量远远不足W 满足市场需求。而且，最新的研究发现鼠源NGF和人源NGF在生理、生化和生物特性上存在显 著的差异，并且在人细胞中鼠源NGF的生物活性显著低于人源NGF。此外，由于鼠源NGF对人 来说是一种外源蛋白，在使用鼠源NGF进行治疗可能会导致病人产生免疫反应，不太安全。
[0004] 为了消除鼠源NGF用于人类治疗时带来的上述问题，已经有许多研究尝试通过大 肠杆菌、酵母、昆虫细胞，哺乳动物细胞等表达系统来生产人源NGF。但是运些细胞系统表达 人源NGF的产量通常较低，并且其中一些系统无法对其所合成的人源NGF提供正确的翻译后 修饰，影响人源NGF的药用效果。同时，已有团队尝试利用转基因兔的乳腺作为生物反应器 生产人源NGF。但乳腺作为生物反应器存在如下缺陷：1)只有性成熟后并且处在哺乳期的雌 性动物才能分泌乳汁;2)乳汁的分泌量有限;3)乳汁含有大量的内源蛋白，不利于从乳汁中 纯化出所特异表达的外源蛋白即人源NGF。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是提供一种转人神经生长因子基因的小鼠，通过转基因方法将人源 NGF序列插入小鼠第5号染色体上，并获得能在第5号染色体上稳定遗传人源NGF基因序列和 在唾液腺组织特异表达具有生物活性的人源NGF的转人神经生长因子基因的小鼠，并利用 该转人神经生长因子基因的小鼠唾液腺作为生物反应器生产人源NGF药物，且从转人神经 生长因子基因的小鼠分泌的唾液中分离纯化出人源NGF，并将人源NGF应用于人类疾病的治 疗。由于小鼠唾液分泌量大，产生的人源NGF也多，而且唾液中内源蛋白较少，便于人源NGF 的分离纯化;且唾液腺能对NGF产生正确的翻译后修饰，产生的NGF是人源化的，其在人类疾 病治疗时不会产生免疫反应，更加安全，因此可W解决上述问题。
[0006] 根据本发明的一个方面，提供了转人神经生长因子基因的小鼠，该转人神经生长 因子基因的小鼠的基因组中包含人源NGF基因序列，且该转人神经生长因子基因的小鼠唾 液腺特异表达人源NGF。由此，该转人神经生长因子基因的小鼠可W通过唾液分泌来产生人 源NGF，再对唾液中人源NGF进行分离提纯，得到纯化后的人源NGF并可用于人类疾病的治 疗。该转人神经生长因子基因的小鼠可W通过繁殖来获得数量庞大的家系，并源源不断的 产生唾液，从而获得更多的人源NGF，而且能在唾液腺中进行正确的翻译后修饰，W及唾液 中内源蛋白较少便于人源NGF的分离纯化。而该人源NGF是人源化的，在用于人类疾病治疗 时不会产生免疫反应，更加安全。
[0007] 在一些实施方式中，该人神经生长因子基因序列如SEQ ID NO: 1所示。
[000引在一些实施方式中，该人神经生长因子基因序列整合在转人神经生长因子基因的 小鼠的第5号染色体上。
[0009] 在一些实施方式中，该人神经生长因子基因序列整合在转人神经生长因子基因的 小鼠的第5号染色体的qu曰nine nucleotide-binding protein subunit曰Iph曰-12基因与 caspase recruitment domain-containing protein 11 基因间的非编码间隔序列上的一 个叮TAA"位点中，且qu曰nine nucleotide-binding protein subunit 曰Iph曰-12与caspase recruitment domain-containing protein 11基因是小鼠第5号染色体上的已知公开基 因。由此，人源NGF基因序列整合在转人神经生长因子基因的小鼠的第5号染色体且定点插 入第5号染色体qimnine nucleotide-bindin邑 protein subunit 曰Iph曰-12基因与c曰sp曰se recruitment domain-confining protein 11 基因间的非编码间隔序列上的一个"TTAA" 位点中，该转人神经生长因子基因的小鼠在唾液腺中特异表达人源NGF及从该转人神经生 长因子基因的小鼠唾液中分离纯化的人源NGF药物具有更好的生物活性，对人类相关疾病 的治疗具有更好的效果。
[0010] 根据本发明的另一个方面，提供了转人神经生长因子基因的小鼠的制备方法，该 转人神经生长因子基因的小鼠通过转基因技术将人源NGF整合到小鼠基因组中，并能在转 人神经生长因子基因的小鼠后代中稳定的遗传。因此，通过该方法可W获得能在后代中稳 定遗传的包含人源NGF基因序列的转人神经生长因子基因的小鼠，且该转人神经生长因子 基因的小鼠的唾液腺特异分泌人源NGF，唾液中分泌的人源NGF被分离纯化后可用于人类疾 病的治疗，且通过该方法获得的转人神经生长因子基因的小鼠，及通过该转人神经生长因 子基因的小鼠分离纯化的人源NGF，产量高、不会对人类产生免疫反应更加安全，该方法包 括如下步骤：
[0011] (1)构建转座子载体，该转座子载体包含如SEQ ID NO: 1所示的人源NGF基因序列、 如SEQ ID N0:5所示的腮腺分泌蛋白基因启动子序列、如SEQ ID N0:6所示的转座子 口1邑邑78日〇5'末端重复序列和如560 10^:7所示的转座子91肖肖78日。3'末端重复序列；
[0012] (2)将构建好的转座子载体注射至小鼠受精卵的雄原核，然后将注射后的小鼠受 精卵移植至代孕母鼠的子宫内，饲养代孕母鼠至小鼠出生；
[OOU] (3)对出生的小鼠进行检测，筛选出人源NGF基因能在后代中稳定遗传的转人神经 生长因子基因的小鼠。
[0014] 在一些实施方式中，转座子载体的序列如SEQ ID N0:8所示。
[0015] 在一些实施方式中，转座子载体整合在转人神经生长因子基因的小鼠的第5号染 色体的qu曰nine nucleotide-binding protein subunit 曰Iph曰-12基因与c曰sp曰se recruitment domain-containing proteinll基因间的非编码间隔序列上的一个"TTAA"位 点中。
[0016] 根据本发明的另一个方面，提供了制备人神经生长因子药物的方法，通过建立利 用转人神经生长因子基因的小鼠的唾液腺作为生物反应器生产人源NGF药物的方法，获得 在唾液腺组织特异表达具有生物活性的人源NGF的转人神经生长因子基因的小鼠，且从转 人神经生长因子基因的小鼠分泌的唾液中分离纯化出人源NGF，通过该方法获得的人源NGF 产量更高、生物安全性更好，该方法包括如下步骤：
[0017] 1)根据上述方法培养转人神经生长因子基因的小鼠，该转人神经生长因子基因的 小鼠为根据权利要求上述转人神经生长因子基因的小鼠；
[001引2)从步骤1)中所述转人神经生长因子基因的小鼠的唾液中分离纯化出人源NGF药 物。
[0019] 在一些实施方式中，该人源NGF药物能够促进NGF受体细胞增殖。
[0020] 在一些实施方式中，该人源NGF药物能够做成制剂用于人类疾病的治疗。
【附图说明】
[0021 ]图1为转座子载体结构示意图。
[00剖图2为转基因原代小鼠 PCR检测电泳结果图，图中"N"表示空白对照，"WT"表示野生 型小鼠，甲'表示阳性对照，表示Marker标记，"557-569"表示转基因原代小鼠。
[0023] 图3为转基因原代小鼠的巧光结果图。
[0024] 图4为转基因原代小鼠的Southern blot结果图，图中表示Marker标记，"P (3C)"表示阳性对照（3个拷贝），"P(5Cr表示阳性对照（5个拷贝），"WT"表示野生型小鼠， "557-56沪表示转基因原代小鼠。
[0025] 图5为转基因原代小鼠腮腺中hNGF mRNA的相对表达量检测结果。
[00%]图6为转人神经生长因子基因的小鼠家系中唾液分泌NGF的浓度检测结果。
[0027]图7为包含人源NGF基因序列的转座子载体序列整合在553家系转人神经生长因子 基因的小鼠第5号染色体上的比对结果分析图。
[002引图8为转人神经生长因子基因的小鼠不同组织中hNGF检测结果图，图中表示 Marker标记，"TG"表示转人神经生长因子基因的小鼠，叩a"表示腮腺，"Sm"表示颂下腺， "S1"表示舌下腺，"Muscle"表示肌肉，"Liver"表示肝脏，"Lung"表示肺，"Fat"表示脂肪， 叮estis"表示睾丸组织，"N"表示空白对照，"WT Pa"表示野生型小鼠腮腺。
[0029] 图9为转人神经生长因子基因的小鼠3个唾液腺组织中hNGF mRNA相对表达量检测 结果图。
[0030] 图10为转人神经生长因子基因的小鼠及野生型小鼠分别在白光及巧光下照片结 果，图中叮G"表示转人神经生长因子基因的小鼠，"WT"表示野生型小鼠。
[0031 ]图11为转人神经生长因子基因的小鼠及野生型小鼠 3个唾液腺组织中mNGF表达检 测结果图，图中"WT male"表示野生型公鼠，"WT female"表示野生型母鼠，"