一种采用橄榄油发酵法制备鞘糖脂的方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物技术领域，特别设及一种采用橄揽油发酵法制备銷糖脂的方法。
【背景技术】
[0002] 橄揽油在地中海沿岸国家有几千年的历史，含有比任何植物油都要高的不饱和脂 肪酸、丰富的维生素4、0、6少、1(和胡萝|>素等脂溶性维生素及抗氧化物等多种成分，并且不 含胆固醇，因而人体消化吸收率极高。橄揽油中橄揽油富含与皮肤亲和力极佳的角整締和 人体必需脂肪酸，吸收迅速，有效保持皮肤弹性和润泽，而橄揽油中所含丰富的单不饱和脂 肪酸和维生素 E及酪类抗氧化物质，能消除面部皱纹，延缓肌肤衰老，有护肤护发和防治手 足皴裂等功效。
[0003] 糖类角质层屏障成分(Glycolipids)即糖脂，是糖类通过其还原末端W糖巧键与 脂类连接起来的化合物，它是自然界中的一类在细胞膜上承担物质传输和能量传递的具有 生理活性的重要物质。鉴于脂质部分的不同，糖脂可分为四类:含銷氨醇的銷糖脂;含甘油 脂的甘油糖脂;含憐酸多茹醇衍生的糖脂;含类固醇衍生的糖脂。其中的銷糖脂(G化S)大多 分布在细胞的膜结构中，由糖基和神经酷胺组成，其神经銷氨醇骨架一侧通过糖巧键连有 寡糖链，另一侧通过酷胺键与脂肪酸相连。
[0004] 目前，通常采用有机全合成方法来制备GSLs，该方法的实验设计主要包括Ξ大部 分:糖供应体的合成、銷氨醇的合成W及通过糖巧化反应获得产物GSLs，该化学合成方法步 骤繁琐、产率低下、合成成本较高，且所设及的试剂污染严重，运些缺陷都不利于工业化生 产。而通过生物发酵方法来获得GSLs成为一种低污染、环境友好的高效生产方式。
[0005] GSLs与神经酷胺的作用类似，它和构成皮肤角质层的物质结构相近，都是在真核 细胞的表面形成一层碳水化合物的网状结构，从而使肌肤达到锁水保湿的功效。其次，G化S 也是细胞脂质双层结构的重要组成部分，有修复肌肤屏障功能的作用。
【发明内容】
[0006] 本发明所需解决的技术问题是:提供一种W橄揽油为原料，通过发酵来获得高附 加值的銷糖脂的方法，该方法获得銷糖脂的产率高、纯度高。
[0007] 为解决上述技术问题，本发明采用W下技术方案：一种W橄揽油为原料制备銷糖 脂的方法，其特征在于采用W下步骤： 八、^橄揽油为碳源，^斯达油脂酵母菌化1口〇1117〇68 3*曰'1?371 2.1608，中国科学院微 生物研究所提供)为菌种，溫度为-l〇°C-20°C，摇床转速为100-30化/min,培养24-4化得到 摇瓶菌种； B、 按W下质量比配制种子培养基：DMEM培养基35-55%，橄揽油30-50%，甘露糖3-7%，麦 芽糖5-12%，棉子糖3-6%，乳酸0.01-0.3%，酵母粉0.01-0.1%，谢氏丙酸杆菌0.01-0.05%，四 氨喀晚0.01-0.08%，憐酸盐缓冲液0.1-1.0%调整种子培养基PH到6.3-6.7; C、 按W下质量比配制发酵培养基:EMEM培养基58-90%，硝酸钢10-15%，钢酸锭14-20%， 乳酸ο. ο 1 -ο. 3%，酵母粉ο. ο 1 -ο. 1 %，谢氏丙酸杆菌ο. ο 1 -ο. 05%，四氨喀晚ο. ο 1 -ο. 08%，憐酸 缓冲液0.1-1.0%调节发酵培养基的ΡΗ到6.0-7.0; D、 将摇瓶菌种接种到种子培养基中，接种体积分率为5-10%，溫度为37-50°C，转速为 150 -30化/min，振荡培养24-3化，得种子培养液； E、 取5-15血步骤D所得种子培养液接种到100-150mL的发酵培养基中，于45-75°C、150- 30化/min的条件下摇床振荡培养3-化； F、 、对培养液进行过滤精制，去除发酵培养基中的细胞及未发酵完全的底物控或碳源 物质，得含有銷糖脂的溶液，经过冷冻干燥得含有銷糖脂的粉末。
[0008] 上述制备过程中选择W硝酸钢与钢酸锭为发酵培养基的无机盐类，上述两者的混 合物为氮源，使得锭和硝基在菌体生长和产物合成中共同协作，从而可达到提高銷糖脂产 量的目的。W单糖甘露糖、双糖麦芽糖、Ξ糖棉子糖作为发酵所用的糖类物质，Ξ者协同作 用共同提供产物銷糖脂的糖极性头，提高了发酵产率。经测定本发明所得粉末中銷糖脂的 含量为 8.5%-10.0%。
[0009] 所述种子培养基的组成及制备方法如下表1所示： 表1:种子培养基的组成及其制备方法
所述发酵培养基的组成及其制备方法如下表2所示： 表2:发酵培养基的组成及其制备方法
将实施例1步骤四中得到的产物进行定性定量检测，其结构如图1所示。
[0010] 薄层色谱：岛津CS-9301双波长飞点薄层扫描仪，光密度扫描范围200nm-370nm，扫 描方式normal扫描结合difference扫描，反射光谱方式SX=3。取銷糖脂标准样，加入到甲醇 中制得ImL含0.05mg的溶液，作为对照品溶液，W苯-异丙醇-水(4:1:1)作为展开剂。然后分 别取样品与制得的标准样各化L，点板展开，惊干后进行巧光扫描测定，通过对比巧光强度 的积分值得到所测样品中銷糖脂的纯度为8.85%。其中硅胶板中斑点对照图如图2所示。
[0011] 质谱仪:安捷伦6420,电喷雾电离源(ESI)，正离子电离模式，离子源溫度100°C，脱 溶剂溫度250°C，脱溶剂氮气流速4(K)L/h。刮取样品与标准样斑点位置一致的硅胶，用乙醇 洗脱后浓缩作为测试样品。测试结果为，该銷糖脂的长骨链骨架为dl8:l，正离子模式下的 m/z为264.3,而在本测试结果中，高能总离子流量图显示的m/z值与理论值相一致，说明所 测物质中存在该骨架的銷糖脂。其中，其高能总离子流量图3所示，骨架结构如图4所示。
[0012] 另外，正离子模式下m/z=379.1证明该物质的糖极性头中含有糖醒酸(m=176.07) 和半乳糖(m=162.05)，其二级质谱图如图5所示。综上所述，可确定得到的产物为图1中所示 结构。
[001引实施例1所制备样品的功效评价 将实施例1中得到的样品添加到乳液体系中，按表3配方进行对比试验，考察其保湿效 果。其中，配方二为添加0.5%实施例1所制备样品，配方一为对照组。
[0014]表3考察实施例1所制备样品保湿功效的乳液配方
随机抽取50名，年龄20-35岁左右的女性志愿者为实验对象，编号1-50,仪器为 Corneometre CM825，测试环境为一个空气流动相对稳定，且室溫25 ± 2°C，湿度40 ± 5%的房 间内，被测试者在测试前至少在测试房间内斜躺30min，使皮肤与测试的标准环境有一个平 衡和相对稳定的基值。然后，分别取配方一与配方二的乳液各2 mL分别均匀涂抹在受试者 面部左右两侧，涂抹30 min后，观察其使用前后面部水分的对照情况。
[0015] 图6中A、B和C分别为50名志愿者在未涂抹乳液前和涂抹配方一乳液与涂抹配方二 乳液30min后的皮肤水分含量的平均值(A为未涂抹乳液前的测试值，B为涂抹配方一乳液的 测试值，C为涂抹配方二乳液的测试值）。从图中可明显看出，在涂抹含有实施例1制备样品 的配方二乳液后，皮肤的水分含量值比未涂抹乳液前提高了 100%，而在涂抹配方一的乳液 后，水分含量只提高了50%，说明实施例1所制备的样品能够在很大程度上提高皮肤的含水 量，从而达到保湿的功效。
【附图说明】
[0016] 图1为銷糖脂的结构图，其中R=C也C也C00H; 图2为薄层扫描斑点对照图； 图3样品高能总离子流量图； 图4銷糖脂的长骨链骨架结构图； 图5糖极性头的二级质谱图； 图6皮肤水分含量测试图表。
【具体实施方式】
[0017] 下面结合实施例进一步说明本发明，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本 发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修