一种海参卵肽钙螯合物的制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及基于海参的功能活性物质制备领域，更具体地说，设及一种海参卵肤 巧馨合物的制备方法。
【背景技术】
[0002] 近年来，中国海参产业发展迅速，据2015年渔业年鉴报道，中国海参总产量约为20 万吨。海参卵是海参加工过程中产生的副产物之一，然而海参卵的回收利用一直被人们所 忽视，通常被当作工业废料，不仅是对生物资源的浪费，还会造成环境污染。
[0003] 巧是人体必需的常量元素，不仅是骨骼和牙齿的重要组成成分，也是机体代谢活 动的调节因子，参与肌肉收缩、神经传导、血液凝集、激素分泌、酶激活、细胞生长等生理活 动。缺巧会影响儿童的正常生长发育，易引发何僕病，而且还会导致中老年人患骨质疏松 症。历次全国营养调查结果显示，巧是我国居民最容易缺乏的膳食营养素。我国人民的膳食 W植物性食物为主，含巧量少，植物成分如草酸、植酸等还影响巧的吸收。因此开发高效的 补巧制剂显得尤为重要。
[0004] 目前市场上的无机巧和有机巧制剂在小肠弱碱性环境下会部分形成沉淀，导致巧 的吸收率不足40%。研究发现活性肤(如酪蛋白憐酸肤、卵黄高憐蛋白憐酸肤、大豆肤、鱼鱗 肤等)能与巧结合形成可溶性复合物，维持人体小肠内巧的可溶状态，具有良好的促巧吸收 能力，运与其巧离子结合活性密切相关。利用生物酶法获取海参卵生物活性肤来制备肤巧 馨合物的研究，还未见相关的文献报道。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于开发一种海参制备高附加值产品的加工方法，提高海参的经济 价值及利用率，避免资源浪费与环境污染；另一方面，根据海参卵中蛋白质高的特点，开发 一种利用海参卵制备具有良好促巧吸收能力的肤巧馨合物的方法。
[0006] 为达到上述目的，本发明提供了一种海参卵肤巧馨合物的制备方法，包括如下步 骤：
[0007] S1、海参卵预处理:将海参卵匀浆，沸水浴5~lOmin，得到海参卵匀浆液；
[000引S2、向步骤S1制得的海参卵匀浆液中加入正己烧/无水乙醇混合液萃取脱脂，所述 正己烧/无水乙醇混合液中正己烧与无水乙醇的体积比为2~3:1，所述海参卵匀浆液与所 述正己烧/无水乙醇混合液的体积比为1:10~15,50°C萃取4~化；
[0009] 所述萃取脱脂过程重复1~2次;抽滤，所得滤饼自然风干、粉碎，得到海参卵脱脂 粉，采用凯氏定氮仪测定蛋白含量；
[0010] S3、向步骤S2制得的海参卵脱脂粉加水至底物蛋白浓度为2~4g/100mL制得酶解 反应液，按300(KU/g底物蛋白）的比例向所述酶解反应液中加入蛋白酶进行酶解反应，反应 3~化;调抑至7.0，100°C灭酶lOmin，4000;r/min离屯、20min，收集上清液，冷冻干燥即得海参 卵酶解物；
[0011] S4、将步骤S3制得的海参卵酶解物与CaCl2溶液、憐酸盐缓冲液混合，得到馨合反 应液，所述馨合反应液中酶解物终浓度为0.5mg/mL，化Cl2终浓度为5mmol/L，憐酸盐缓冲液 终浓度为20mmol/l;将所述馨合反应液在模拟人体回肠条件下进行馨合反应化后，5000Xg 离屯、lOmin，取上清液经0.45μπι水系微孔滤膜过滤后，冻干、粉碎即得海参卵肤巧馨合物;所 述模拟回肠条件为控制反应液溫度37°C、控制反应液抑为7.0。
[0012] 优选方式下，步骤S3所述蛋白酶为膜蛋白酶、碱性蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白 酶或风味蛋白酶中的一种。
[0013] 最优方式下，步骤S3所述蛋白酶为中性蛋白酶、风味蛋白酶或木瓜蛋白酶时，调节 所述酶解反应液pH至7.0，溫度为50°C ;所述蛋白酶为碱性蛋白酶时，调节所述酶解反应液 pH至8.5，溫度为50°C ;所述蛋白酶为膜蛋白酶时，调节所述酶解反应液pH至8.0，溫度为37 Γ。
[0014] 优选方式下，步骤S4所述模拟回肠条件控制反应液抑的方法为采用抑计监测反应 液抑，采用Imol/L的肥1溶液或Imol/L的NaO田容液调整抑。
[0015] 本发明的技术创新在于：
[0016] 1、本发明方法提高了海参加工过程中副产物的利用率，使其含有的活性物质得到 充分开发利用，同时减少了对环境的污染。
[0017] 2、本发明通过生物酶法获取海参卵生物活性肤，与巧离子结合形成的可溶性肤巧 馨合物，更有利于巧吸收，可用于开发高值化的海参卵肤-巧补充剂。
[0018] 3、肤巧馨合物主要在人体回肠部位被吸收，本发明在模拟回肠条件下制备海参卵 肤巧馨合物，其在小肠弱碱性环境下不会形成沉淀，到达回肠时仍可维持巧的可溶状态，具 有良好的促巧吸收能力。
[0019] 4、本发明设及的操作过程简单，不需要复杂的设备，由膜蛋白酶酶解获取海参卵 肤的肤得率和巧结合量最高，其中肤得率达到86 %，巧结合量达0.38mmo 1 /L，而且具有良好 的促巧吸收能力，提高了生产效率，适合工业化生产。
【附图说明】
[0020] 图1为5种商业酶酶解海参卵的肤得率结果。
[0021] 图2为5种商业酶酶解制备的海参卵肤的巧离子结合量。
[0022] 图3为海参卵肤巧馨合物经肠道细胞的促巧吸收效应。
【具体实施方式】
[0023] W下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神 和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。
[0024] 实施例1
[0025] 1、海参卵流水解冻，用去离子水冲洗干净，匀浆后，沸水浴中煮沸5min进行变性预 处理，得到海参卵匀浆液；
[0026] 2、取海参卵匀浆液，加入10倍体积的正己烧/无水乙醇(3:1)混合液lOOmL，在50°C 萃取化，重复1~2次，除去脂肪，抽滤后所得滤饼自然风干，获到海参卵脱脂粉，采用凯氏定 氮仪测定蛋白含量；
[0027] 3、准确称取海参卵脱脂粉，补水至底物蛋白浓度为2g/100mL，分别加入膜蛋白酶、 碱性蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、风味蛋白酶在最适酶解条件下(本专利里的最适条 件是根据酶自身的最适条件确定的，如表1所示)对海参卵酶解化，酶解后调pH至7.0,在100 °C灭酶lOmin，40(K)r/min离屯、20min，收集上清液，冷冻干燥即得海参卵酶解物。
[00%]表1为海参卵脱脂粉的酶解条件。
[0029] 表 1
[0030]
[0032] 实施例2:肤得率的测定
[0033] 1、配制0.5mg/mL牛血清白蛋白（BSA)标准溶液:精密分析天平准确称取0.05g BSA 于1 OOmL洁净烧杯中，超纯水溶解，定容至1 OOmL。
[0034] 2、化1 in-酪法绘制BSA标准曲线：本实验WBSA作为标准品绘制标准曲线。取18个 2. OmL离屯、管分成3组。分别加0，20，40，60，80，100化标准品溶液，并用超纯水补足到lOOyL， W上每种浓度做3个平行。各管浓度依次为0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5mg/mL。按顺序向各管内 依次加入50化L化lin-酪甲液，混匀。室溫下放置lOmin，再加入50化化lin-酪乙液，立即 振荡均匀，室溫下放置30min。每管取20化L溶液加入96孔板中，且每管加2次。在50化m波长 下，用酶标仪测定光密度值。WBSA浓度为横坐标，光密度值(0化00)为纵坐标，绘制标准曲 线。
[0035] 3、海参卵酶解物中TCA-可溶性寡肤含量的测定：在酶解液中加入等体积预冷的 20 % TCA溶液，振荡均匀，室溫下静置20min，1200化pm离屯、lOmin，取上清液，稀释一定倍数， 采用化lin-酪法测定海参卵酶解物中TCA-可溶性