大肠菌检测方法以及其中使用的试剂盒的制作方法
【专利说明】大肠菌检测方法从及其中使用的试剂盒
[0001 ] 本发明专利申请是国际申请号为PCT/US2009/069629，国际申请日为2009年12月 29日，进入中国国家阶段的申请号为200980157395.3，发明名称为"大肠菌检测方法W及其 中使用的试剂盒"的中国发明专利申请的分案申请。
[醒]优先权声明
[0003] 本专利申请要求下述美国临时专利申请的优先权:2009年12月9日提交的61/267， 860; 2008年 12月31 日提交的61/141,900; 2008年 12月31 日提交的61/141,813;和2008年 12 月31日提交的61/141，685;上述美国临时专利申请的内容W引用方式并入本文。
技术领域
[0004] 本发明设及用于检测试验样品中微生物的存在的方法。在另一方面，本发明还设 及用于实施运种方法的诊断试剂盒。
【背景技术】
[0005] 在饮用水检测和食品安全检测中，大肠菌的存在与否被认为是重要的品质依据， 并且在饮用水和某些食品（例如，乳制品）中允许的大肠菌的量在世界各地的多个国家中是 有规定的。大肠菌包括粪便大肠菌，例如大肠杆菌。食品或水样品中存在的粪便大肠菌被用 作食品或水的粪便污染W及可能存在的其他病原微生物的主要指示物。
[0006] 用于检测、鉴定和/或计数水样品中的微生物的方法可见于（例如）美国公共卫生 协会（American 化blic Health Association)、美国自来水工程协会（American Water Works Association)和水环境联合会(Water Environment Federation)联合出版的第21 版纲要 "Sl:andard Methods for the Examination of Water and Wastewater" ("SMEWW") (水和废水检验标准方法KSMEWW描述了下述膜过滤技术，其常常用于水检测中，W便获得 W相对低浓度存在于相对大量的水中的微生物的直接计数。在实施运项技术中，使特定体 积的水穿过膜过滤器，将该膜在培养基或装置中解育特定时间段，随后将所得微生物菌落 进行计数。膜过滤技术可用于监测样品的微生物品质，运些样品来自旨在生产饮用水的工 艺，W及来自于各种天然的、未处理的水源。
[0007] 用于检测、鉴定和/或计数食品样品中的微生物的方法通常根据食品的特性W及 可能存在于样品中的微生物的类型而有所不同。用于检测食品样品的方法概要包括：由美 国公共卫生协会（Washington,D.C.)公布的第27版"Standard Methods for the Examination of Daily Products"(乳品检验标准方法），W及由美国食品药品管理局（the U.S.Food and Drug Administration .Washington ,D . C.)公布的"Bacteriological Analytical Manuar ("BAM")(细菌学分析手册）。通常将固体食品悬浮于水性介质中，并混 合和/或研磨W得到可用于微生物定量分析方法中的食品材料的匀浆液。
[000引然而，上述参考方法通常相对昂贵、设及复杂的步骤、和/或需要相对复杂的仪器 和/或相对较高受训程度的人员。例如，大多数膜过滤技术需要灭菌设备、真空歧管和结果 的人工判读。另一个缺点为膜过滤器可被小颗粒(例如，泥沙、粉尘、诱或其他悬浮颗粒)堵 塞ο
[0009] 诸如离屯、之类的技术需要用于采样大体积(例如，大于50毫升的体积)的专用电源 设备，并且从运种体积中回收相对低数量的微生物需要相对长的时间段。用于样品的微生 物分析的培养装置通常可仅容纳相对小的样品种菌体积(例如，大约1毫升）。运种局限性在 水检测领域中尤其成问题，因为美国环境保护局（U . S . Environmental Protection Agency)水质检测条例(例如)规定检测大（100毫升)水样品体积。
【发明内容】
[0010] 因此，我们认识到迫切需要用于快速检测、鉴定和/或计数病原微生物的方法。所 述方法将优选不仅快速而且成本低、简单(不设及复杂的设备或程序）、和/或在多种条件下 (例如，不同类型样品基质和/或病原微生物、不同微生物负荷、W及不同样品体积)有效。具 体地讲，我们认识到需要用于检测、鉴定和/或定量试验样品（例如，用于饮用水和食品安全 检测）中的大肠菌的简单、有效和/或高性价比的方法。
[0011] 简而言之，在一个方面，本发明提供了用于检测样品中存在或不存在大肠菌的方 法。所述方法包括：
[0012] (a)提供至少一个疑似包含至少一种大肠菌菌株的样品（优选地，为流体形式;更 优选地，水样品）；
[0013] (b)提供至少一个培养装置，其包括至少一种水合的或可水合的培养基；
[0014] (C)提供至少一种粒状浓集剂，其在培养基为水合的情况下与培养装置中的培养 基相接触时为基本上光学透明的；
[0015] (d)设置粒状浓集剂与样品相接触(优选地，通过混合进行），使得大肠菌菌株的至 少一部分结合至粒状浓集剂或被粒状浓集剂捕集，W形成结合大肠菌的粒状浓集剂；
[0016] (e)设置结合大肠菌的粒状浓集剂与培养装置的培养基相接触；
[0017] (f)解育包括与培养基(所述培养基为水合的）相接触的结合大肠菌的粒状浓集剂 的培养装置;W及
[0018] (g)在不将大肠菌菌株与粒状浓集剂分离的情况下，光学检测大肠菌菌株的存在 (例如，大肠菌菌株的至少一个菌落的存在）。
[0019] 优选地，大肠菌为产气大肠菌(更优选地，大肠杆菌化schericMa coli))，培养装 置包括含有至少一种可发酵营养物质的培养基(更优选地，培养装置为包括含有至少一种 可发酵营养物质的培养基的平膜培养装置），粒状浓集剂包括微粒(更优选地，无机微粒）， 和/或光学检测包括检测至少一种颜色变化(更优选地，至少一种颜色变化W及邻近大肠菌 菌株的至少一个菌落的至少一个气泡的存在）。
[0020] 所述方法还优选包括离析(优选地，通过重力沉降）结合大肠菌的粒状浓集剂、从 样品中分离所得离析的结合大肠菌的粒状浓集剂、鉴定大肠菌菌株、和/或定量或计数大肠 菌浓度。光学检测步骤可为人工的或自动的。
[0021] 已经发现，某些相对低成本的粒状浓集剂可有效浓集大肠菌(包括(例如)相对大 体积的样品（例如，100毫升水样品）中的相对低含量的大肠菌），使得细菌不但保持活性W 用于检测或分析，而且令人惊讶地可在存在(并且没有分离或去除)粒状浓集剂的情况下进 行光学检测或分析(甚至通过自动光学检测系统）。运种粒状浓集剂可用于浓集存在于样品 (例如，食品或水样品）中的大肠菌菌株，w使得可更容易和快速地分析大肠菌菌株中的一 个或多个。
[0022] 令人惊讶地是，用于本发明方法中的粒状浓集剂通常不会显著干扰大肠菌代谢 (包括酶和/或气体产生)和菌落生长，或干扰检测、鉴定和/或定量大肠菌通常所依据的大 肠菌菌落指示物特性(例如，颜色变化和/或气泡）。因此，令人惊讶地是，解育和检测期间所 存在的粒状浓集剂通常不会显著降低大肠菌检测的精确度，包括专口鉴定大肠杆菌(运对 于通过食品和/或饮用水品质检测来保持公共健康至关重要，如上所述)所需的更严格检 测。
[0023] 本发明的方法可在水检测中（其中水样品通常包含相对低数量的大肠菌)提供增 加的采样效率(例如，相对于0.1 mL常规未浓集的平板接种体积，能够使样品体积增加约两 个数量级和/或使可检测微生物浓度降低约两个数量级），并且可通过使用粒状浓集剂避免 与使用用于浓集的膜过滤器相关的过滤器堵塞问题。通过能够有效的样品浓集，所述方法 可与可仅容纳相对小样品种菌体积(例如，约1毫升)的培养装置相容。
[0024] 本发明的方法相对简单并且成本低(不需要复杂设备、昂贵的菌株特异性材料或 高受训程度的人员）并且可在现场相对快速地实施(优选实施例能够在约22至24小时内检 测大肠菌），而不需要较复杂现有技术的大肠菌检测方法(例如，膜过滤)通常所需的专口配 备的实验室装置。另外，所述方法可对多种大肠菌和多种样品（不同样品基质，并且不同于 至少一些现有技术的方法，甚至为具有低大肠菌含量和/或大体积的样品）有效。因此，本发 明的方法的至少一些实施例可满足上述对于在多种条件下快速检测病原微生物(特别是大 肠菌)的低成本、简单方法的迫切需要。
[0025] 在另一方面，本发明还提供了用于实施本发明方法的诊断（或样品检测)试剂盒， 所述试剂盒包括：
[0026] (a)至少一种培养装置，其包括至少一种水合的或可水合的培养基;和
[0027] (b)至少一种粒状浓集剂，其在培养基为水合的情况下与培养装置中的培养基相 接触时为基本上光学透明的。
【具体实施方式】
[0028] 在W下详细说明中，描述了各组数值范围（例如，特定部分中的碳原子数的数值范 围、特定组分的量的数值范围等等），并且在每组数值范围内，范围的任何下限可与范围的 任何上限配对。运种数值范围另外旨在包括包含在该范围内的所有数(例如，1至5包括1、 1.5、2、2.75、3、3.80、4、5等等）。
[0029] 如本文所用，术语"和/或"意指所列要素的一个或全部，或所列要素的任何两个或 更多个的组合。
[0030] 术语"优选的"和"优选地"是指本发明的实施例在某些情况下可提供一定的益处。 然而，其他实施例在相同或其他情况下也可能是优选的。此外，对一个或多个优选实施例的 表述并不暗示其它实施例是不可用的，且并非意图将其它实施例排除在本发明范围之外。
[0031] 当术语"包含"及其变型出现在【具体实施方式】和权利要求中时不具有限制的意思。
[0032] 本文所用的"一种(个)"、"所述(该)"、"至少一种(个rw及"一种或多种(一个或 多个r可互换使用。因此，例如，疑似包含"一种"祀大肠菌的液体样品可被理解为是指该液 体样品可包含"一种或多种"祀大肠菌。
[0033] 上述"
【发明内容】
"部分并非旨在描述本发明的每个实施例或每种实施方式。W下具 体实施方式更具体地描述了示例性实施例。在整个【具体实施方式】中，通过实例的列表提供 指导，运些实例可W各种组合使用。在每种情况下，所述列表仅用作代表性的组类，并且不 应解释为排他性列表。
[0034] 室义
[0035] 利申请中使用的：
[0036] "大肠菌菌株"是指可通过检测方法区分的特定类型的大肠菌（例如，不同属的大 肠菌、属内不同种的大肠菌、或种内不同隔离群的大肠菌）；
[0037] "浓集剂"是指结合包括大肠菌在内的微生物的材料或组合物(优选地，微生物捕 集或结合效率为至少约60 % ;更优选地，至少约70 % ;甚至更优选地，至少约80 % ;最优选 地，至少约90%);
[0038] "培养装置"是指可用于在将允许至少一个细胞发生分裂的条件下繁殖微生物(包 括大肠菌）的装置(优选地，培养装置包括用于降低或最小化偶发污染可能性的壳体和/或 支持微生物生长的营养物质源）；
[0039] "检测"是指鉴定微生物(例如，祀大肠菌）的至少一种组分，由此确定微生物的存 在；
[0040] "遗传检测"是指对来自祀大肠菌的遗传物质组分(如DNA或RNA)的鉴定；
[0041] "免疫检测"是指对来自祀大肠菌的抗原物质(如蛋白质或蛋白多糖)的鉴定；
[0042] "微生物"是指具有适于分析或检测的遗传物质的任何细胞或粒子(包括(例如)细 菌、酵母、病毒和细菌内生抱子）；
[0043] "光学检测"是指对通过培养装置或培养基(包含至少一个微生物或微生物菌落） 透射的、吸收的、发射的、反射的、折射的、散射的、或者说是转换的（优选地，至少部分透射 的）且用作至少一个大