同步检测肉及肉制品中动物源性成分的试剂盒及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明设及一种同步检测肉及肉制品中动物源性成分的试剂盒，同时还设及该试 剂盒的应用，属于肉及肉制品分子生物学鉴别/检测技术领域。
【背景技术】
[0002] 民W食为天，食W安为先，吃放屯、健康绿色的肉类制品是食品质量安全的一个重 要方面。但是在动物源性原料和加工产品中，经常出现动物成分渗假、造假、渗杂和无意污 染的现象。国内市场近期曝光的多起肉类渗假事件已引起公众对食品安全的担忧，即使在 拥有世界上最严格食品安全制度的欧洲，亦难免出现挂羊头卖狗肉的造假现象。
[0003] 牛肉是全世界人民钟爱的肉类食品，富含氨基酸、维生素 Bi2、铁元素等营养成分， 并且牛肉中蛋白质含量高，脂肪含量低，味道极为鲜美，享有"肉中娇子"的美称。目前，市场 上牛肉的价格普遍高于其他肉类，运也使得一些不法商贩在利润的驱使下W次充好，用便 宜、劣质的牛肉替换优质牛肉进行销售，甚至一些商贩直接挂羊头卖狗肉，用其他肉类冒充 牛肉进行销售。
[0004] 肉的渗假设及食品安全、公共卫生、宗教等诸多方面，对人们生活有极大的负面影 响，不仅严重违反肉类市场公平竞争的准则，也会严重影响消费者的身屯、健康，损害消费者 权益。在肉类渗假形式层出不穷的当下，开发并应用能快速、准确鉴别动物源性成分的新技 术已成为食品安全领域的研究热点。
[0005] 传统的动物源性成分检测方法设及解剖学、组织学、化学、生物化学、光谱、色谱、 免疫学等诸多领域技术，包括基于核酸的分子生物学技术(如PCR、实时定量PCR、分子指纹 技术等）、基于蛋白质分子结构的免疫分析技术、红外光谱技术W及质谱技术等，但均表现 出一定的局限性。如公布号CN105177150A的发明专利公开的一种猪羊牛动物源性成分的多 重PCR引物体系，包括针对猪12SrDNA基因设计的引物对I、针对羊细胞色素 C氧化酶亚基虹 基因设计的引物对Π 、针对牛TNFRSF10A基因设计的引物对虹，检测方法包括待检样品 总DNA为模板，利用引物Ι、Π 、虹进行多重PCR扩增，扩增完毕凝胶电泳判定结果，扩增出 290bp条带即包含猪源性成分，370bp条带包含羊源性成分，190bp条带包含牛源性成分，该 方法操作简便，灵敏度高、特异性强，可同时对样品中猪羊牛3种动物源性成分作出检测分 析，但是对引物配比有一定的要求，并且鉴定物种的数量有限，操作繁琐且检测结果准确性 欠佳。
[0006] 近些年，基于DNA分子技术的发展，WDNA尤其是线粒体DNA为基础的物种鉴定方法 优越性凸显。线粒体DNA在高溫下稳定，且普遍存在于大多数细胞和组织中，不受个体形态 特征限制(取样量小，样本受损不影响识别结果），也不受个体发育阶段影响，便于提取获得 (与常规基因组DNA提取方法无异），在生物学研究中应用广泛。基于线粒体细胞色素 C氧化 酶亚单位基因 I(COI)的DNA条形码技术在动物研究中应用广泛，所采用的标准片段是线粒 体C0I基因中的一段DNA，通过该标准片段对物种进行快速、准确的识别和鉴定。然而，该技 术尚未在肉及肉制品动物源性成分检测中应用。
【发明内容】
[0007] 本发明的目的是提供一种同步检测肉及肉制品中动物源性成分的试剂盒。
[0008] 同时，本发明再提供一种上述试剂盒在同步检测肉及肉制品中动物源性成分方面 的应用。
[0009] 为了实现W上目的，本发明所采用的技术方案是：
[0010] 同步检测肉及肉制品中动物源性成分的试剂盒，包含化an酶及引物对H/1;
[00川引物对H/L为：
[0012] LC01490:5 '-GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG-3 '，
[001 引 HC02198:5 '-TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA-3 '。
[0014] 具体的，该试剂盒还可W包含Taq MasterMix(含染料）、肥Buffe;r、DNA Marker、去 离子水等。
[0015] 上述试剂盒在同步检测肉及肉制品中动物源性成分方面的应用，包括包含C0I 基因的待测样品DNA为模板，利用引物对H/L进行PCR扩增，扩增产物经化an酶酶切消化后 凝胶电泳分析，根据特征性酶切条带判定结果；
[0016] 所述引物对H/L为：
[0017] LC01490:5 '-GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG-3 '，
[0018] HC02198:5 '-TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA-3 '。
[0019] 所述PCR扩增的反应体系为：2XTaq MasterMix(含染料）5化，10叫/化模板DNA化 L，1 Opmo 1 /L引物LC01490、肥02198各0.化L，去离子水3.化L，总体积10化。
[0020] 所述PCR扩增的反应程序为:94°C预变性5min;94°C变性3〇3,40°(：退火3〇3,72°(：延 伸60s，45个循环；72°C延伸lOmin。
[0021] 所述酶切消化的反应体系为：上述PCR扩增产物化L、lOunits/化化a Π 酶0.化L、 10 X肥Buf f er 1.化L，去离子水化L，总体积10化。
[0022] 所述酶切消化的反应条件为:37°C下，酶切15min。
[0023] 所述特征性酶切条带与动物源性成分的对应关系为：牛，500bp、7化P;羊，500bp、 40069、23069、12069、8化9;猪，35069、24069、12069;鸡，35069、24069;乌鸡，45069、3506口、 240bp;鱼，280bp、200bp、120bp;鼠，380bp、350bp;鸭，350bp、280bp、230bp。
[0024] 本发明的有益效果：
[0025] 本发明中试剂盒同步检测肉及肉制品中动物源性成分的原理为:提取待检测样品 基因组DNA，用单一通用引物扩增样品线粒体DNA C0I区段中的目的片段(710bp)，扩增后采 用1%琼脂糖凝胶电泳检测扩增结果，结果显示与目的片段条带一致，再用特定限制性内切 酶将其酶切为不同大小的物种特异性DNA片段，采用3%琼脂糖凝胶电泳分析酶切结果，根 据特征性酶切条带判定样品中物种组成。若牛肉样品中出现其他物种的特征性酶切条带， 即表示牛肉中渗杂有其他肉类，可达到检测牛肉渗假的目的。
[00%]本发明利用DNA条形码技术(DNA Barcoding)，针对线粒体基因高度保守的特性， 使用单一通用引物扩增和单一限制性内切酶酶切，通过对扩增和酶切结果的电泳检测及分 析，能够准确、快速地对肉及肉制品中动物源性成分进行检测，具有操作简便、准确可靠、检 测时间短(她左右得到检测结果）、性价比高、多物种同时鉴别等优点，可在动物食品（包括 熟肉制品）安全检测领域广泛推广应用。
【附图说明】
[0027] 图1为试验例中PCR产物检测的琼脂糖凝胶电泳图；
[0028] 图2为单一肉样PCR产物酶切结果检测的琼脂糖凝胶电泳图；
[0029] 图3为混合肉样PCR产物酶切结果检测的琼脂糖凝胶电泳图；
[0030] 图4为用于灵敏度检测的混合肉样PCR产物琼脂糖凝胶电泳图；
[0031 ]图5为用于灵敏度检测的混合肉样PCR产物酶切产物琼脂糖凝胶电泳图；
[0032] 图6为市售冷鲜肉PCR产物检测的琼脂糖凝胶电泳图；
[0033] 图7为市售冷鲜肉PCR产物酶切结果检测的琼脂糖凝胶电泳图。
【具体实施方式】
[0034] 下述实施例仅对本发明作进一步详细说明，但不构成对本发明的任何限制。
[0035] 实施例1
[0036] 同步检测肉及肉制品中动物源性成分的试剂盒，包含化an酶及引物对H/1;
[0037] 引物对H/L为：
[0038] LC01490:5，-GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG-3，，
[OOW] HC02198:5，-TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA-3，。
[0040] 实施例2
[0041 ] 同步检测肉及肉制品中动物源性成分的试剂盒，包含化aΠ 酶2000units、lOpmol/ L引物LC01490、肥02198各5mL、2XTaq MasterMix(含染料）50mL、10X肥Buffer 30血、DNA Marker及去离子水ΙΟΟιΛ;
[0042] 引物对H/L为：
[0043] LC01490:5 '-GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG-3 '，
[0044] HC02198:5 '-TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA-3 '。
[0045] 试验例
[0046] -、检测范围分析
[0047] 1、材料准备及基因组DNA的提取、检测 [004引1)基因组DNA的提取
[0049] W牛肉、羊肉、猪肉、鸡肉、乌鸡肉、鱼肉、鼠肉、鸭肉的单一肉样W及牛/羊、牛/猪、 牛/鸡、牛/鱼、牛/羊/猪、羊/猪等的混合肉样为材料，置2(TC下保存至DNA提取，采用通用型 柱式基因组提取试剂盒(购自康为世纪生物科技有限公司）提取基因组DNA，具体操作按照 试剂盒说明书进行，提取的基因组DNA于4°C下保存备用；
[0050] 2)微量分光光度计检测基因组DNA浓度
[0051] 采用微量分光光度计（Thermo