Its序列作为dna条形码在鉴定嘉兴槜李中的应用及鉴定方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及分子鉴定技术领域，尤其设及ITS序列作为DNA条形码在鉴定嘉兴携李 中的应用及鉴定方法。
【背景技术】
[0002] 携李（Primus salicina Lindl.)是菩薇科（Rosaceae)李属（Primus L.)植物，是 浙江省嘉兴市特产，也是浙江省传统名果。携李品质细腻鲜润，完熟时能化成甘甜略带酒香 的浆液，风味品质极佳，是夏季消费者喜爱的优质水果之一。目前除浙江嘉兴的桐乡、海宁、 海盐、湖州等地有携李栽培外，在江苏省和安徽省也有少量引种。
[0003] 携李多采用嫁接繁殖，在不同栽培区域进行引种嫁接，极易造成同名异物及同物 异名的现象。另外携李受不同栽培管理方法、±壤及气候条件的影响，果实在成熟期的生物 学特性及品质外观方面呈现一定的差异，市场上鱼目混珠给消费者带来极大困惑。
[0004] 传统的植物分类方法是借助于对植物形态构造、生活习性等进行比较研究，随着 科技的不断进步，植物分类方法逐步发展到分子生物学方法。目前，尚无关于嘉兴携李分子 鉴定的文献报道，关于携李的研究多集中在栽培及低坐果率方面。由于携李的果实外观受 不同栽培管理方法、±壤及气候条件的影响，果实色泽往往不同，仅仅依靠果实形态来区分 携李与其他品种李难度较大，依靠传统的形态分类学方法在嘉兴携李的鉴别上存在局限 性。鉴于嘉兴携李在地方特产及农业领域的重要地位，针对嘉兴携李建立一套可靠的分子 鉴别方法势在必行，对于嘉兴携李的种质资源保护具有重要意义。
[0005] DNA条形码(DNA barcoding)技术是利用标准的、具有足够变异的、易扩增且相对 较短的DNA片段在物种内的特异性和物种间的多样性而创建的一种新的生物身份识别系 统，可实现对物种的快速自动鉴定。该技术已被成功应用于生物物种分类和鉴定等领域，并 成为进展最迅速的学科前沿之一。
[0006] DNA条形码技术研究中常用的DNA序列有111曰证、付址可364、&化和口5等。核基因组 的ITS区位于18S和26S rRNA基因之间，被5.8S rRNA基因分为两段，即ITS1和ITS2,是核糖 体DNA(nrDNA)转录单位的一部分。在被子植物中，ITS区具有长度保守性和核巧酸序列的高 度变异性，使得运些间隔区的DNA序列较为容易排序，而高度变异性可W为重建较低分类阶 元的系统发育提供分子证据。ITS序列区间已经广泛地应用于植物分类、起源、进化等方面 的研究。
[0007] 现有研究报道中，王化坤等选择桃、李、梅、杏、樓桃各2~4个主要种或变种共16个 基因型测定其ITS序列，与从GenBank下载的6个核果类果树口S序列形成了较为全面的数据 矩阵。采用二次置根法用樓桃置根，用PAUP软件计算数据集在56个进化模型的得分， Modeltest筛选最佳模型和参数，计算遗传距离、变异，用最大简约法构建了桃、李、梅、杏、 樓桃的系统发育树。
【发明内容】
[0008] 本发明通过实验研究发现嘉兴携李的ITS序列的第165位和第195位的碱基与其他 品种存在差异，基于W上发现，本发明提供了口 S序列作为DNA条形码在鉴定嘉兴携李中的 应用。
[0009] ITS序列作为DNA条形码在鉴定嘉兴携李中的应用，所述口 S序列的碱基序列如SEQ ID NO. 1 或沈Q ID NO.2所示。
[0010] 嘉兴携李早熟品种的口S序列如SEQ ID NO. 1所示，晚熟品种的口S序列如SEQ ID NO. 2所示。
[0011] 本发明还提供了 ITS序列作为DM条形码在制备鉴定嘉兴携李试剂盒中的应用，所 述口5序列的碱基序列如56〇10^.1或56〇10^.2所示。
[0012] 本发明将嘉兴携李(包括早熟和晚熟）与其他品种李的ITS序列比对，早熟和晚熟 品种的嘉兴携李的ITS序列在第165位和第195位的碱基皆为?'，与其他品种李的碱基不 同，基于运点，通过比对第165和195位的碱基，即可判断待测样品是否为嘉兴携李。
[0013] 本发明提供了一种鉴定嘉兴携李的方法，包括W下步骤：
[0014] 利用PCR扩增待测样品的ITS序列并进行测序，如果ITS序列的16加 P碱基为?'、 195bp碱基为叩'，则判定待测样品为嘉兴携李。
[0015] 鉴定范围包括浙江嘉兴携李、宁波茄皮李、舟山金塘李、福建红屯、李、湖北玉皇李、 贵州九巧李、安徽麦宽李、江西朱砂李、山东牛屯、李、美国恐龙蛋、美国拉罗达、美国玫瑰皇 后、美国安哥里诺、日本大石早生、日本白李、日本秋姬、日本贵陵和新西兰密斯李。
[0016] 本发明对嘉兴携李的早熟和晚熟品种的ITS序列进行比对，发现两者在第168位、 285位和第331位碱基存在差异，基于运点，本发明还可W对嘉兴携李的早熟和晚熟品种进 行鉴别。
[0017] 本发明提供了一种鉴别嘉兴携李早熟品种和晚熟品种的方法，包括W下步骤：
[0018] 利用PCR扩增待测样品的口S序列并进行测序，如果口S序列的碱基序列如SEQ ID NO. 1所示，在33化P碱基为"C"，则判定待测样品为嘉兴携李早熟品种;如果口 S序列的碱基 序列如5日〇10^.2所示，在16869碱基为"心'、28化9碱基为"心'，则判定待测样品为嘉兴携 李晚熟品种。
[0019] 所述PCR扩增的引物对为：
[0020] 上游引物：5 ' -GCCTAGCAGAACGACCCGAG-3 '，
[0021] 下游引物:5 ' -GACGTGTGACGCCCAGGCA-3 '。
[0022] 所述PCR扩增的反应体系为：
[002引 10 X PCR缓冲液，化L dNTP混合液，0. ΙΟμΜ上游引物，0 . ΙΟμΜ下游引物， 0. 样品DNA，化L; Taq DNA聚合酶，0. 补充无菌水至20化。
[0024] 所述PCR扩增的反应条件为：
[0025] 94°C 预变性 5min;94°C 变性 3〇8,56°(：退火3〇3,72°(：延伸3〇3，共36个循环;72°(：延 伸 10min;4°C 保溫 5min。
[00%]本发明还提供了一种鉴定嘉兴携李的DNA条形码，碱基序列如SEQ ID N0.1或SEQ ID NO.2所示。
[0027]与传统的形态学鉴定方法和DM指纹标记相比，本发明利用口S序列作为DNA条形 码鉴定嘉兴携李，可通过对ITS序列进行PCR扩增和测序，直接获得鉴定结果，检测准确性 高、可重复性高，鉴定时间短。
【附图说明】
[0028] 图1是嘉兴携李果实照片。
[0029] 图2是本发明的嘉兴携李及其他品种李ITS序列PCR扩增结果电泳图，其中，泳道2 ~20分别为:浙江嘉兴携李(早熟KT1)、浙江嘉兴携李(晚熟）（Τ2)、宁波茄皮李(T3)、舟山 金塘李(Τ4)、福建红屯、李(Τ5)、湖北玉皇李(Τ6)、贵州九巧李(Τ7)、安徽麦宽李(Τ8)、江西朱 砂李(T9)、山东牛屯、李(Τ10)、美国恐龙蛋(Τ11)、美国拉罗达(Τ12)、美国玫瑰皇后(Τ13)、美 国安哥里诺(Τ14)、日本大石早生(Τ15)、日本白李(Τ16)、日本秋姬(Τ17)、日本贵陵（Τ18)、 新西兰密斯李（Τ19)，Μ为DL2000plus DNA marker。
[0030] 图3是嘉兴携李及其他品种李ITS序列的比对，黑色箭头分别标注嘉兴携李ITS序 列的序列特异位点，第16化P碱基为叩'、19化P碱基为叩'。
【具体实施方式】
[0031 ]下面结合【具体实施方式】进一步阐释本发明。
[0032] 实施例1携李的分子鉴定
[0033] 分别从浙江省嘉兴市李子园艺科学研究所取样，19个鉴定样品分别为浙江嘉兴携 李(早熟）（Τ1)、浙江嘉兴携李（晚熟KT2)、宁波茄皮李(T3)、舟山金塘李(T4)、福建红屯、李 (Τ5)、湖北玉皇李（Τ6)、贵州九巧李(Τ7)、安徽麦宽李(Τ8)、江西朱砂李（T9)、山东牛屯、李 (Τ10)、美国恐龙蛋(Τ11)、美国拉罗达(Τ12)、美国玫瑰皇后(Τ13)、美国安哥里诺(Τ14)、日 本大石早生(Τ15)、日本白李(Τ16)、日本秋姬(Τ17)、日本贵陵(Τ18)、新西兰密斯李(Τ19)。 携李果实照片参见附图1。
[0034] 利用CTAB法提取上述携李叶片的基因组DNA，利用下述引物对进行PCR扩增，PCR扩 增使用：rTaq(Takara，大连，中国）。
[0035] Trapa-F1:5 '-GCCTAGCAGAACGACCCGAG-3 '；
[0036] Trapa-Rl:5 '-GACGTGTGACGCCCAGGCA-3 '。
[0037] PCR扩增体系为：10 XPCR buffer JyLdNTP mixture，0.扣1^;1〇4]? Prunus-Fl引 物，0.5化；ΙΟμΜ Prunus-Rl引物，0.5化;样品DNA^L Taq DNA聚合酶，0.2化;补充无菌水至 20化。
[003引 PCR扩增条件为:94°C预变性5min;94°C变性308,56。(：退火303,72。(：延伸303，共36 个循环；72°C延伸10min;4°C保溫5min。
[0039] 使用1.5%琼脂糖凝胶对PCR扩增产物进行检测，鉴定。电泳图谱参见附图2。
[0040] 将PCR产物送由生物公司纯化后测序(测序所用引物与PCR所用引物相同），所得基 因序列经校正后即为目的基因序列。用DNAMAN序列比对软件进行多重序列比对。序列比对 结果见附图3。携李的口S序列在16化P碱基为叩'、19化P碱基为叩'。
【主权项】
1. ITS序列作为DNA条形码在鉴定嘉兴携李中的应用，所述ITS序列的碱基序列如SEQ ID NO. 1 或SEQ ID NO.2所示。 2. ITS序列作为DNA条形码在制备鉴定嘉兴携李试剂盒中的应用，所述ITS序列的碱基 序列如SEQIDN0.1或SEQIDN0.2所示。3. -种鉴定嘉兴携李的方法，包括以下步骤： 利用PCR扩增待测样品的ITS序列并进行测序，如果ITS序列的165bp碱基为"T"、195bp 碱基为"T"，则判定待测样品为嘉兴携李。4. 一种鉴别嘉兴携李早熟品种和晚熟品种的方法，包括以下步骤： 利用PCR扩增待测样品的ITS序列并进行测序，如果ITS序列的碱基序列如SEQ ID NO. 1 所示，则判定待测样品为嘉兴携李早熟品种;如果ITS序列的碱基序列如SEQ ID NO.2所示， 则判定待测样品为嘉兴携李晚熟品种。5. 如权利要求3或4所述的方法，其特征在于，所述PCR扩增的引物对为： 上游引物:5 ' -GCCTAGCAGAACGACCCGAG-3 '， 下游引物:5 ' -GACGTGTGACGCCCAGGCA-3 '。6. 如权利要求3或4所述的方法，其特征在于，所述PCR扩增的反应体系为： 10. PCR 缓冲液，2yL; dNTP 混合液，0.5yL; 1 ΟμΜ上游引物，0.5yL; 1 ΟμΜ下游引物，0.5yL; 样品DNA，lyL; Taq DNA聚合酶，0.2yL;补充无菌水至20yL。7. 如权利要求3或4所述的方法，其特征在于，所述PCR扩增的反应条件为： 94°C预变性5min;94°C变性3〇8,56°(：退火3〇8,72°(：延伸3〇8，共36个循环；72°(：延伸 10min；4〇C/i7^iU5min〇8. -种鉴定嘉兴携李的DNA条形码，其特征在于，碱基序列如SEQ ID NO. 1或SEQ ID NO. 2所示。
【专利摘要】本发明公开了ITS序列作为DNA条形码在鉴定嘉兴槜李中的应用及鉴定方法，属于分子鉴定技术领域。所述鉴定方法包括：利用PCR扩增待测样品的ITS序列并进行测序，如果ITS序列的165bp碱基为“T”、195bp碱基为“T”，则判定待测样品为嘉兴槜李。本发明还公开了一种鉴别嘉兴槜李早熟品种和晚熟品种的方法，如果ITS序列的碱基序列如SEQ？ID？NO.1所示，则判定待测样品为嘉兴槜李早熟品种；如果ITS序列的碱基序列如SEQ？ID？NO.2所示，则判定待测样品为嘉兴槜李晚熟品种。本发明利用ITS序列作为DNA条形码鉴定嘉兴槜李，检测准确性高、可重复性高，鉴定时间短。
【IPC分类】C12N15/11, C12Q1/68
【公开号】CN105671185
【申请号】CN201610186877
【发明人】李军, 李白, 李斌
【申请人】浙江省嘉兴市农业科学研究院（所）
【公开日】2016年6月15日
【申请日】2016年3月29日