基于lamp技术检测李痘病毒的引物、试剂盒及检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及一种基于LAMP技术检测李痘病毒的引物、试剂盒及检测方法，属于生 物技术领域。
【背景技术】
[0002] 李痘病毒Plum pox virus，PPV是核果类果树危险性最大的病毒之一，果树一旦受 其侵染，则会造成未成熟果实大量脱落，使产量严重降低，并且使果实品质大幅度下降，而 且该病毒传播速度快，在短时间内即可能给整个国家的果树业发展带来灾难性损失。该病 毒1915年在保加利亚首次被发现，而后迅速传遍欧洲大多数国家W及地中海、中非、印度和 智利，目前美国和加拿大也有其发生的报道。由于该病毒危害性及其严重，因此它已被欧洲 植保组织列入了 A2类检疫性病原物，其它国家也对其表现出极高度的重视，纷纷加大对其 研究的力度并制定了一系列严格的检测和根除措施，防范于未然。目前中国暂未有发现有 关该病毒的正式报道，由于目前我国同其他国家种质资源交流越来越频繁，为了防止该病 毒随着苗木等繁殖材料的引进而进入我国，W保护我国农业的健康和可持续发展，必须加 强对该病毒的检验检疫。
[0003] 目前，我国出入境植物病毒检测所采用的主要技术方法是酶联免疫吸附化ISA检 测和反转录聚合酶链式反应RT-PCR检测。传统的ELISA技术在实际应用过程中存在检测灵 敏度低，检测耗时长，容易出现假阳性结果;RT-PCR技术虽然灵敏度高，但是存在RNA抽提繁 琐并且容易降解，PCR反应容易受寄主中多酪、多糖物质的干扰，难W实现植物病毒病害样 品的快速、简便、高效检测。因此，建立新的快速、简捷、灵敏的检验检疫技术手段已经迫在 眉睫。
[0004] 植物病毒病的诊断和病原鉴定，是认识病毒病害、防治病毒病的基础，也是植物病 毒分类学研究的一个重要内容，植物病毒检测的基本内容包括病毒的生物学特性、形态学 特征、理化特性、基因组结构、抗原特性等几个方面，设及到生物学测定、血清学测定、生理 生化测定、电镜技术、分子生物学技术等多种手段。目前，我国出入境植物检疫所采用的检 测技术的主要手段主要是：口岸现场检疫、生长季隔离检疫、指示植物检验、血清学检验、分 子生物学检验。运些手段存在的主要问题为：1:检测周期长，不符合国务院提出的"加快通 关速度"的精神;2:容易出现假阳性反应;3:检测方法繁琐复杂，不利于基层单位实际应用； 4:主要检测试剂或产品来源于国外公司，不仅购买价格高，而且定购时间长，运些都不能适 应我国经济快速发展的需要。因此，建立新的快速有效的检验检疫技术手段已经迫在眉睫。
[0005] 目前对病毒的主要技术检测方法是酶联免疫吸附化ISA检测和反转录聚合酶链式 反应RT-PCR检测。ELISA可W定性、定量测定样品中的病毒，是实现目前鉴定病毒的最好手 段之一。但是，血清学反应的必须具备高效的抗血清，另外血清学检测对一些病毒含量低和 含有干扰测定物质的样品则不能做出准确的测定，容易出现假阳性的结果，并且存在检测 时间长的问题，不能满足目前口岸快速检测的要求;RT-PCR技术是应用最广泛的分子生物 学新技术之一，利用RT-PCR技术对病毒的检测相比化ISA检测具有灵敏度高的特点，可检测 的最低病毒含量达到fg水平。目前在RT-PCR技术基础上不断衍生出许多新的技术，例如实 时巧光RT-PCR技术，基因忍片技术等，使其应用范围不断扩大，特异性和敏感性也不断提 高，但是运些分子生物学技术存在RNA抽提繁琐并且容易降解，PCR反应容易受寄主中多酪、 多糖物质的干扰，限制了植物病毒病害样品的快速、简便、高效检测。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的是为了克服现有技术中的不足之处，提供一种快速、简便、高效、准 确性高、特异性强、灵敏性高，基于LAMP技术检测李痘病毒的引物；
[0007] 本发明另一个目的是提供一种包含上述引物的用于检测李痘病毒的试剂盒；
[0008] 本发明另一个目的是提供一种采用上述试剂盒检测李痘病毒的方法。
[0009] 为了达到上述目的，本发明采用W下方案：
[0010] -种基于LAMP技术检测李痘病毒的引物，其特征在于包括：
[0011] 正向外引物尸3:5'-〇：1'17641'1'1'(：了4〔6464了64(：-3'；
[0012] 反向外引物83:5'-40：4(：了4〔4押0：0：1'(：-3'；
[001引正向内引物FIP:
[0014] 5'-TCCAAGCCAAATAAACGATTTTGAAGTGAGGCACATATTCAAATGAAGG-3'；
[0015] 其中所述正向内引物FIP包含Flc和F2序列：
[0016] F1C：5'-TCCAAGCCAAATAAACGATTTTGAA-3'；
[0017] F2：5'-GTGAGGCACATATTCAAATGAAGG-3'；
[001引反向内引物BIP:
[0019] 5 '-GGAAACGTCGAAACACAAGAAGAGAGGAGGTTGTGCATGTTG-3 '；
[0020] 其中所述反向内引物BIP包括含Blc和B2序列：
[0021] 其中Blc:5'-GGAAACGTCGAAACACAAGAAG-3' ；
[0022] B2:5 '-AGAGGAGGTTGTGCATGTTG-3 '。
[002；3] 环引物；
[0024] LF:5'-CATTTCTCAATGCTGCTG-3'；
[00巧]LB:5，-ACCGCTGGTGATGTTAA-3，。
[0026] -种基于LAMP技术检测李痘病毒的试剂盒，其特征在于该试剂盒包括有： 2 X反应液缓冲液 0.日址 引物 ΙΙΟμΙ 酶溶液 bO μ I
[0027] 阳性对照 撕化 对照引物溶液 2日u L 去离子水 1狐qal
[0028] 所述的引物包括：
[00 巧]正向外引物尸3:5'-〇：1'17641'1'1'(：了4〔6464了64(：-3'；
[0030] 反向外引物83:5'-40：4(：了4〔4押0：0：1'(：-3'；
[0031] 正向内引物FIP:
[00；32 ] 5' -TCCAAGCCAAATAAACGATTTTGAAGTGAGGCACATATTCAAATGAAGG-3';
[0033] 其中所述正向内引物FIP包含Flc和F2序列：
[0034] F1C：5'-TCCAAGCCAAATAAACGATTTTGAA-3'；
[0035] F2：5'-GTGAGGCACATATTCAAATGAAGG-3'；
[0036] 反向内引物BIP:
[00；37] 5 ' -GGAAACGTCGAAACACAAGAAGAGAGGAGGTTGTGCATGTTG-3 ' ；
[0038] 其中所述反向内引物BIP包括含Blc和B2序列：
[0039] 其中 B1C: 5 ' -GGAAACGTCGAAACACAAGAAG-3 ' ；
[0040] B2:5 '-AGAGGAGGTTGTGCATGTTG-3 '。
[004。环引物；
[0042] LF:5'-CATTTCTCAATGCTGCTG-3'；
[0043] LB:5 '-ACCGCTGGTGATGTTAA-3 '
[0044] 其中该试剂盒的产品规格:50次。
[0045] 如上所述的试剂盒，其特征在于所述的2 X反应液缓冲液由W下组分组成： P撇.8 的 Tris-HCl 40raM KCl 20mM
[0046] Μ 换化 Ι&βΜ (饥Μ)這化 20(Μ.? Tween20 0.2% Betaine '1'.投Μ
[0047] dNTPs 2.8πιΜ 。
[004引如上所述的试剂盒，其特征在于所述的酶溶液为Bst DM聚合酶和AMV逆转录酶混 合液。
[0049] 如上所述的任一种试剂盒，其特征在于在所述反应缓冲液中含有巧黄绿素巧光染 料。
[0050] -种基于LAMP技术检测李痘病毒的方法，其特征在于包括W下步骤：
[0051 ] A、采用纳米磁珠提取待测样品的RNA;
[0052] B、采用如权利要求5所述的试剂盒，在冰上，按比例取反应液缓冲液、引物、酶溶 液、阳性对照、去离子水放入灭菌管中配制预混液；
[0053] C、将适量待测样品的RNA加入步骤B中的灭菌管中；
[0054] D、将步骤C中的试管放置在AB7500巧光定量PCR仪中，在63°C下保持恒溫1小时；
[0055] E、如果待检样品与阳性对照一样出现典型的S扩增曲线，则判定为阳性，如果与阴 性对照一样没有扩增曲线，而判定为阴性。
[0056] 如上所述的方法，其特征在于步骤A中采用纳米磁珠提取待测样品RNA的具体步 骤：
[0057] a、制样:取O.lg的带毒组织加入ImL抽提缓冲液进行研磨；
[0化引 b、清洗纳米磁珠:取出免疫纳米磁珠到PCR管中，用dd出0反复清洗纳米磁珠3次， 在磁铁的作用下吸去dd出0;
[0059] C、结合:加入1(Κ)化的样品到PCR管中，用移液枪吸吐混匀样品和纳米磁珠，室溫下 吸附；
[0060] d、清洗:在磁铁的作用下移去上清，纳米磁珠清洗3次；
[OOW] e、裂解:加入50化d地2昭化CR管中，用移液枪吸吐混匀纳米磁珠后，95 °C，lOmin;
[0062] f取样:用磁铁吸附纳米磁珠，待PCR管内溶液澄清后，上清即为待测样品RNA。
[0063] 如上所述的方法，其特征在于所述的免疫纳米磁珠通过W下工艺制作：
[0064] ①纳米磁珠的制备
[00化]分别取5.2g 化Cl3 ·細2〇、2.7g FeS〇4 · 7H2〇、0.85mL 12.1moL/L的浓盐酸溶解于 200mL水中，超声脱氧，后将W上溶液滴入250血、0.75nK)L/L化0田容液;在80°C下揽拌，反应 结束后，利用磁分离器将所得沉淀从反应介质中分离出来，再用去离子水清洗