一种锌离子荧光探针化合物、制备方法及应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及分析化学技术领域，尤其涉及一种锌离子荧光探针化合物、制备方法 及其应用。
【背景技术】
[0002] Zn2+是一种重要的微量元素，在动植物体内的许多生理过程中发挥着重要作用，例 如神经信号的传导与调节、基因表达、细胞凋亡和酶催化等诸多方面。因此，Zn 2+的检测，尤 其是活体细胞和组织中Zn2+的测定与荧光显微成像技术成为近年来化学家和生物学家们非 常关注的领域之一。但不同于其它过渡态金属离子，Zn 2+由于最外层电子分布为3(^43而不 显示任何波谱或磁信号，所以设计合成高选择性和高灵敏度的Zn2+荧光探针就显得尤为重 要。
[0003] 传统Zn2+荧光探针的设计从原理上一般分为分子内电荷转移（ICT)、光诱导电子转 移(PET)、荧光共振能量转移(FRET)、扭曲分子内电荷转移(TICT)和亚胺异构化等机理。但 是这些机理存在着一些缺陷，例如ICT受pH值的影响比较大，PET受结构的影响比较大，TICT 和亚胺异构化是Zn2+的结合导致其分子内扭曲的间接测量结果。而激发态分子内质子转移 (ESIPT)机理是指某些有机分子受光激发后，分子中某一基团上的质子(通常为羟基或氨 基）转移到分子内邻近N、0、S等杂原子上，形成互变异构体的过程。当其与Zn 2+相结合时， ESIPT进程受到抑制，表现出斯托克斯位移(Stokes shift)，实现对Zn2+的检测。
[0004] 理想的Zn2+荧光探针还应同时具备化学光稳定性好、选择性和灵敏性高、良好的脂 溶性兼水溶性、对细胞毒害作用小以及对细胞pH值环境不敏感等性质，从而实现其在生物 领域中的广泛应用。
【发明内容】
[0005] 本发明的一个目的在于提出一种分子结构简单、产率高、对锌离子具有良好的选 择性和灵敏性的锌离子荧光探针化合物。
[0006] 本发明的另一个目的在于提出一种工艺简单、原料易得、易于实施的锌离子荧光 探针化合物的制备方法。
[0007] 本发明的再一个目的在于提出一种锌离子荧光探针化合物的应用。
[0008] 为达此目的，一方面，本发明采用以下技术方案：
[0009] -种锌离子焚光探针化合物，其化学分子式为C15H13NO4,分子结构式为：
[0010]
[0011]优选的，所述锌离子荧光探针化合物是以2-(2'-羟基苯基)苯并噁唑化合物为母 体结构，经过衍生化得到的。
[0012] 另一方面，本发明采用以下技术方案：
[0013] -种锌离子荧光探针化合物的制备方法，按下列步骤进行：
[0014] 步骤A、将2-(2 羟基苯基）苯并噁唑溶解于三氟乙酸溶液中，分批加入六亚甲基 四胺对原料进行甲酰化，纯化后得到中间体I;
[0015] 步骤B、将硼氢化钠逐步加入到中间体I的甲醇溶液中进行反应；
[0016] 步骤C、减压并蒸发去除溶剂后进行纯化；
[0017] 步骤D、将步骤C中纯化后的有机相在二氯甲烷中重结晶，获得最终化合物。
[0018] 优选的，步骤A中的所述中间体I的化学分子式为C15H9NO4,分子结构式为：
[0019] <w>n
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[0020]优选的，所述最终化合物其化学分子式为C15H13NO4,分子结构式为：
[0021]
[0022] 优选的，步骤A中，对原料进行甲酰化后进行步骤A2,步骤A2为，加热回流至反应完 全；
[0023] 优选的，步骤A2后进行步骤A3，步骤A3为，将反应完全后的溶液冷却后加入盐酸酸 化，并采用乙酸乙酯溶液进行萃取；
[0024] 优选的，步骤A3后进行步骤A4,步骤A4为，对步骤A3获得的有机相用饱和食盐水冲 洗后用无水硫酸钠干燥；
[0025] 优选的，步骤A4后进行步骤A5,步骤A5为采用柱层析方式对步骤A4中干燥后的有 机相进行分离获得所述中间体I;
[0026] 优选的，2_( 2 羟基苯基)苯并噁唑与六亚甲基四胺的摩尔比为1:2;
[0027]优选的，步骤A5中，所述柱层析方式采用的洗脱剂包括乙酸乙酯、正己烷；
[0028] 优选的，步骤A5中，乙酸乙酯与正己烷的比例为7:1。
[0029] 优选的，步骤B中，中间体I与硼氢化钠的摩尔比为1:4;
[0030] 优选的，步骤B中，在冰浴条件下将硼氢化钠分批加入到中间体I的甲醇溶液中。 [0031]优选的，步骤C中，采用柱层析方式进行纯化；
[0032]优选的，步骤C中，所述柱层析方式采用的洗脱剂包括乙酸乙酯、正己烷；
[0033] 优选的，步骤C中，乙酸乙酯与正己烷的比例为1:1。
[0034] 再一方面，本发明采用以下技术方案：
[0035] -种锌离子荧光探针化合物的应用，锌离子荧光探针用于动物细胞中锌离子的检 测。
[0036] 还一方面，本发明采用以下技术方案：
[0037] -种锌离子荧光探针化合物的应用，锌离子荧光探针用于在植物体内的传导以及 植物体内锌离子的检测。
[0038]本发明的有益效果为：
[0039] 本发明提供的锌离子荧光探针化合物分子结构简单、产率高、对锌离子选择性好、 灵敏度高、抗其它金属离子干扰能力强、对pH值变化不敏感，并且更适合应用于动植物体系 中，是一种理想的锌离子传感分子。
[0040] 本发明提供的锌离子荧光探针化合物的制备方法工艺简单、原料易得、易于实施 且探针产率高。
【附图说明】
[0041] 图1是本发明提供的锌离子荧光探针化合物的合成路线图；
[0042] 图2是本发明提供的锌离子荧光探针化合物在HEPES缓冲溶液中对不同金属离子 的选择性光谱图；
[0043]图3是本发明提供的锌离子荧光探针化合物在HEPES缓冲溶液中加入不同金属离 子后荧光强度变化柱状图；
[0044]图4是本发明提供的锌离子荧光探针化合物在HEPES缓冲溶液中逐渐加入Zn2+后紫 外吸收光谱变化图；
[0045]图5是本发明提供的锌离子荧光探针化合物在HEPES缓冲溶液中逐渐加入Zn2+后荧 光发射光谱变化图；
[0046]图6是本发明提供的锌离子荧光探针化合物在HEPES缓冲溶液中加入不同当量Zn2+ 后荧光强度与Zn2+浓度关系曲线图；
[0047]图7是本发明提供的锌离子荧光探针化合物以及与Zn2+相结合形成的络合物的荧 光强度与pH值变化关系图；
[0048]图8a至图8c是本发明提供的锌离子荧光探针化合物在HepG2细胞内检测Zn2+的荧 光成像图；
[0049]图9a和图9b是本发明提供的锌离子荧光探针化合物在植物体内的传导及对Zn2+检 测的荧光图。
【具体实施方式】
[0050] 下面结合附图并通过【具体实施方式】来进一步说明本发明的技术方案。
[0051] 本发明提出一种锌离子荧光探针化合物，对具有激发态分子内质子转移(ESIPT) 特性的苯并噁唑基团进行衍生化而成，具体为以2_(2'_羟基苯基)苯并噁唑化合物为母体 结构，经过衍生化得到的，其化学分子式为C 15H13N04，分子结构式为：
[0052]
[0053]本发明提供的锌离子荧光探针化合物分子结构简单、产率高、对锌离子选择性好、 灵敏度高、抗其它金属离子干扰能力强、对pH值变化不敏感，并且更适合应用于动植物体系 中，是一种理想的锌离子传感分子。
[0054]具体的，本发明提供的锌离子荧光探针化合物对Zn2+的识别具有高选择性，抗其它 金属离子干扰能力强;具有高灵敏性，最低检测限达到78nM;对pH值变化不敏感，在pH值1到 8的范围内，pH值变化对荧光强度没有影响，与Zn2+相结合形成的络合物在pH值为7左右时， 荧光强度达到最大值。
[0055]进一步的，本发明还提供了上述锌离子荧光探针化合物的制备方法，如图1所示， 其制备方法具体按下列步骤进行：
[0056] 步骤A1、将2-(2'_羟基苯基）苯并噁唑（400mg，1.89mmol)溶解于30mL三氟乙酸溶 液中，然后分批加入六亚甲基四胺(489mg，3.78mmo 1)对原料进行甲酰化。
[0057] 步骤A2、加热回流至反应完全，优选的采用TLC法检测反应进程判断反应是否完 全。
[0058]步骤A3、将反应完全后的溶液冷却后加入盐酸酸化，并采用乙酸乙酯溶液进行萃 取，优选的，加入30mL6M的盐酸，然后用乙酸乙酯溶液萃取三次，每次20mL。
[0059] 步骤A4、对步骤A3获得的有机相用饱和食盐水冲洗后用无水硫酸钠干燥，优选的， 用40mL饱和食盐水进行冲洗。
[0060] 步骤A5、纯化，优选采用柱层析方式对步骤A4中干燥后的有机相进行分离获得黄 色粉末中间体I，（洗脱剂：乙酸乙酯/正己烷= 7:1)，产率91%。
[0061 ] 中间体I的化学分子式为C15H9NO4,分子结构式为：
[0062] '-人,*
' 〇
[0063] 优选的，2_( 2 羟基苯基)苯并噁唑与六亚甲基四胺的摩尔比为1:2。
[0064] 步骤B、将中间体I (100mg，0.374mmol)溶解于15mL甲醇溶液中，在冰浴条件下，将 硼氢化钠(57mg，1.5mmol)分批加入到中间体I的甲醇溶液中进行反应，直至搅拌无气泡生 成。
[0065] 步骤C、减压并蒸去大部分溶剂即甲醇后进行纯化，优选采用柱层析方式进行纯 化，（洗脱剂：乙酸乙酯/正己烷= 7:1)。
[0066] 步骤D、将步骤C中纯化后的有机相在二氯甲烷中重结晶，获得白色针状的探针化 合物，产率89 %。
[0067] 此时氢谱图、碳谱图以及质谱图的