从黄绿蜜环菌中提取麦角甾醇的方法及其应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及中药提取技术领域，具体涉及一种从黄绿蜜环菌中提取麦角留醇的方法，以及该得到的麦角留醇在制备抗肝癌药物中的应用。
【背景技术】
[0002]麦角留醇(ergosterol)，又称麦角固醇，是一种重要的植物留醇，主要存在于酵母和麦角中。麦角留醇是生产维生素D2的前体，有维生素D2的作用，也是微生物细胞膜的重要组成部份，对确保细胞膜的完整性、膜结合酶的活性、膜的流动性、细胞活力以及细胞物质运输等起着重要作用。
[0003]研究表明，麦角留醇不仅可用于黄酮类等药物的生产，而且麦角留醇是具有生理活性应用安全天然药物，也是动植物的生长激素，具有消炎、退热、抗溃疡作用，对于治疗宫颈癌、皮肤癌等肿瘤疾病都有明显疗效。麦角留醇还能防止足底、膝及手掌等皮肤干燥及，能防止和抑制鸡眼形成，改善皮肤触感，是生产香水、洗发液、润肤膏等化妆品、护肤品的主要活性成分之一。
[0004]授权公开号为CN102659890B的中国发明专利公开了一种大本中麦角甾醇的提取方法，它采取提取、浓缩、裂解、亲酯提取、皂化、催萃取与提纯等一系列步骤后成功提取到麦角留醇，但是该方法不仅步骤繁琐、耗时，而且其得到的麦角留醇纯度只能达到80%，这对于麦角留醇作为药物组分的纯度要求还存在差距。
【发明内容】
[0005]本发明所要解决的技术问题是针对以上现有技术问题，提供一种从黄绿蜜环菌中提取麦角留醇的方法，该方法采用二维高效液相色谱进行分离纯化，分离方法稳定，重复性高，制备量大，操作简单省时，得到的麦角甾醇纯度可以达到95%以上。
[0006]本发明所采用的技术方案为:
[0007]—种从黄绿蜜环菌中提取麦角留醇的方法，该方法包括以下步骤:
[0008](I)以黄绿蜜环菌子实体为原料，室温阴干处理后，在40?60°C温度下烘干脱水，然后进行超微粉碎处理，获得超微粉；
[0009](2)将超微粉按Ig: (6?15)mL的料液比加入分析纯水，混合均匀后在60?90°C温度下提取I?2h，提取结束后在4000?8000rpm转速下离心，取沉淀重复I?3次，最后得到沉淀放入烘箱50?80°C干燥处理；
[0010](3)在步骤⑵所得的干燥沉淀中按质量体积比(g/mL)加入I?5倍的丙酮冷浸提取3?8h，提取结束后在4000?8000rpm转速下离心，取沉淀重复I?3次，收集所有上清液减压浓缩至膏状，获得小分子提取物；
[0011](4)在小分子提取物中按质量体积百分比(g/mL)加入5?10倍的正己烷-乙酸乙酯二元混合溶剂，进行超声溶解，溶解后过有机滤膜，得到含有小分子提取物的一维上样溶液；
[0012](5)对一维上样溶液进行高效液相色谱分离:采用的色谱柱为Silica正相硅胶色谱柱，采用的流动相为二元混合有机相，其中A相为正己烷，B相为乙酸乙酯，进样量为800-1200mL/针，流动相流速为600_750mL/min，检测器为紫外检测器，检测波长260nm，采用的洗脱方式为A相浓度100%等度洗脱O?15min、A相浓度60% (即按体积百分比A相60%、B相40%配比而成，下同理)等度洗脱15?35min、B相浓度100%等度洗脱35?60min，根据紫外吸收光谱收集25-29min洗脱液(Fr6峰)作为目的组分，减压浓缩至膏状，得到一维液相组分；
[0013](6)在得到的一维液相组分中按质量体积百分比(g/mL)加入5?10倍的正己烷-乙酸乙酯二元混合溶剂，进行超声溶解，溶解后过有机滤膜，得到二维上样溶液；
[0014](7)进行二维高效液相色谱分离:采用的色谱柱为Silica正相硅胶色谱柱，采用的流动相为二元混合有机相，其中A相为正己烷，B相为乙酸乙酯，进样量为20-80mL/针，流动相流速为40-80mL/min，检测器为紫外检测器，检测波长260nm ;采用的洗脱方式为A相浓度88%等度洗脱0-45min，根据紫外吸收光谱收集27.5_36min洗脱液(Fr6_4峰)作为目的组分，旋转蒸发浓缩至干，即为本发明目的化合物麦角甾醇。
[0015]作为优选，所述步骤⑷、(6)中正己烷-乙酸乙酯二元混合溶剂中正己烷的体积分数为50?90%。
[0016]作为优选，所述步骤(5)中的Silica正相硅胶色谱柱的尺寸为直径50mm、柱长250mm，其中硅球粒径为8 μ m，使用时柱温为室温或25-40 °C。
[0017]作为优选，所述步骤(7)中的Silica正相硅胶色谱柱的尺寸为直径50mm、柱长250mm，其中硅球粒径为10 μ m，使用时柱温为室温或25-40°C。
[0018]本发明进一步提供上述提取得到的麦角留醇单体化合物在制备抗肝癌药物中的应用。该麦角留醇单体化合物作为有效成分，按常规方法如口服、注射，与药学上的可接受载体或赋形剂，制成适合口服、注射等给药方式的剂型，如:片剂、胶囊、注射剂等。
[0019]按照本领域普通技术人员的理解，麦角留醇的给药剂量应根据治疗对象的年龄、体重、疾病严重程度等因素而定，一般可以是200-300mg/天。
[0020]由于本发明原料黄绿蜜环菌中的物质极性比较集中，所以本发明选用二维高效液相色谱进行有效组分的提取。
[0021]首先，在一维分离的条件选择上:多次试验结果显示，Silica正相硅胶色谱柱对所提物质分离效果较好，而由于黄绿蜜环菌丙酮提取物极性偏小，呈浓稠油状物，溶解样品时经试验正己烷-乙酸乙酯二元混合溶剂(正己烷体积分数50?90% )溶解性良好，因此选择正己烷、乙酸乙酯为二元混合流动相，而通过考察不同洗脱方式、流速及进样量后，结果显示采用本发明“A相浓度100%等度洗脱O?15min、A相浓度60%等度洗脱15?35min、B相浓度100%等度洗脱35?60min”的洗脱方式时分离效果最佳，且进样量在800-1200mL/针范围内、流动相在600_750mL/min范围内时重复性良好。
[0022]其次，在二维分离的条件选择上:再使用Silica正相硅胶色谱柱，在洗脱条件选择为A相浓度88%等度洗脱时能将少部分极性与麦角留醇比较接近的杂质分离开，得到纯度可达95%的麦角留醇单体化合物。
[0023]总的来说，本发明从黄绿蜜环菌中提取麦角留醇单体化合物的方法工艺简单，时间周期短，试剂耗费量小，制备量大，稳定可控，重复性好，批次一致性较高，得到的麦角甾醇纯度高，稳定性好，可直接用于进行药物制备等后续应用。
【附图说明】
[0024]图1所示的是本发明从黄绿蜜环菌中提取麦角留醇的方法的一维高效液相色谱图，其中(a)为实施例1、(b)为实施例2、(C)为实施例3 ；
[0025]图2所示的是本发明从黄绿蜜环菌中提取麦角留醇的方法的二维高效液相色谱图，其中(a)为实施例1、(b)为实施例2、(C)为实施例3 ；
[0026]图3所示的是本发明得到的目的组分的1D1CNMR谱(MeOD，400MHz)数据；
[0027]图4所示的是本发明得到的目的组分的1D13HNMR谱(MeOD, 400MHz)数据；
[0028]图5所示的是本发明实施例1色谱分离得到的各组分的抑制肝癌细胞增殖图；
[0029]图6所示的是本发明实施例1得到的目的组分在不同浓度条件下抑制肝癌细胞增殖图；
[0030]图7所示的是本发明实例4中细胞给予Fr6-4后的细胞形态图；
[0031]图8所示的是本发明目的产物麦角甾醇的结构式。
【具体实施方式】
[0032]以下结合实施例对本发明作进一步具体描述。应该指出，以下具体说明都是例示性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有说明，本发明使用的所有科学和技术术语具有与本发明所属技术领域人员通常理解的相同含义。
[0033]1、原料、材料:
[0034]黄绿蜜环菌子实体采摘自青海祁连并经过鉴定；Hep-G2细胞由中国医学科学院血液病医院提供。
[0035]2、试剂:
[0036]分析纯水由密立博纯水仪生产；色谱级丙酮、乙酸乙酯、正己烷购自Honeywell公司；DMS