化。
[0018]图3为摩尔比为1:50的生物素修饰肽段(模拟生物素化反应后体内KmeO和Kmel肽段，40pM)和未生物素修饰肽段(模拟生物素化反应后体内Kme2和Kme3肽段，2nM)混合物的MALD1-TOF-MS谱图，MALD1-T0F_MS谱图纵坐标为质谱峰的相对强度(100% Intensity)，横坐标为质荷比(m/z); (A)是未富集的；(B)是经1ul亲和素琼脂糖微球富集后得到的；(C)是经15ul亲和素琼脂糖微球富集后得到的;*为未生物素修饰肽段，#为生物素修饰肽段;对比图(A)、图(B)和图(C)可以看出，15ul亲和素琼脂糖微球能够完全结合40pM的生物素分子，经过富集后，生物素修饰肽段可以被选择性除去，进而非生物素修饰肽段实现高灵敏质谱鉴定。
[0019]图4为500ugHela全蛋白中富集得到的二三甲基化修饰的肽段和蛋白数目，以及二三甲基化蛋白之间的交盖图。
【具体实施方式】
[0020]下面的实施例是对本发明提出的一种基于生物素修饰的甲基化肽段富集并质谱分析方法的进一步说明。
[0021 ]实施例1，EZ_b1tin试剂对肽段N端和赖氨酸侧链氨基的反应效率的实验
将5mM的标准肽段(FQLTDIPAAPR，ALSNSTPQNSFSEK)母液用2%SDS，20mM HepesCPH7.4)，1mM NH4HCO3或者用PBS溶液按照 1:100稀释成0.05禮；用2%505，201111 HepesCPH 7.4)与乙腈按照1:1的比例配制1mM EZ-b1tin，注意避光保存。取1ul 0.05mM肽段与等体积的1mM EZ-b1tin混合，37摄氏度孵育30min后立即取出置于冰上，取上清液0.8 yL点样于MALDI靶板上，待干燥后再点样等体积的α-氰基-4-羟基肉桂酸基质溶液，干燥结晶后进行MALD1-TOF-MS分析，结果如图2所示。
[0022]实施例2，亲和素琼脂糖微球对生物素修饰肽段富集能力的实验
用20mM NaH2PO4，0.15M NaCl (PH7.4)的缓冲液按照摩尔比为1:50配制合成的标准生物素修饰肽段(模拟生物素化反应后体内KmeO和Kmel肽段，总量40pM)和未生物素修饰肽段混合物(模拟生物素化反应后体内Kme2和Kme3肽段，总量2nM)，以下简称混合肽段;在200ul枪头底部填上3M C18材料作为筛板，从枪头顶部分别填入5ul，10ul以及15ul的亲和素琼脂糖微球，300g离心ImindPAlOOul 20mM NaH2PO4^0.15M NaCl(PH7.4)的缓冲液平衡，重复两次，分别向含有填料的枪头中加入混合肽段，300g离心lmin，取流出液反复结合三次，再加入10ul的20mM NaH2PO4,0.15M NaCl(PH7.4)的缓冲液洗涤一次，收集所有的流出液以及洗涤液，合并除盐、冻干，取上清液0.8 yL点样于MALDI靶板上，待干燥后再点样等体积的α-氰基-4-羟基肉桂酸基质溶液，干燥结晶后进行MALD1-T0F-MS分析，结果如图3所示。
[0023]实施例3，基于生物素修饰的二三甲基化肽段亲和富集效果的实验
取 500ug Hela 细胞全蛋白，加入 2%SDS，20mM HepesCPH 7.4) ,1mM NH4HCO3 配制 2ug/ul的蛋白溶液，加入等体积用2%SDS，20mM Hepes(PH 7.4)与乙腈按照1:1的比例配制1mMEZ-b1tin，注意避光保存。37摄氏度孵育30min后加入1ul IM DTT(二硫苏糖醇，溶于25mMNH4HC03)，56°C条件下反应30 min;加入40ul的500mM IAA(碘乙酰胺，溶于25mM MMCO3JIl配现用)，室温避光20分钟，向上述反应后的蛋白溶液中加入5倍体积预冷的丙酮溶液，-20°C静置过夜后14000rpm，4°C离心30分钟，加入丙酮洗涤3次，以彻底去除未完全反应的EZ-b1tin试剂，最后一次吸除丙酮后，将EP管倒扣于通风橱中，使丙酮挥发完全。向所得蛋白粉末中加入SM尿素，重悬沉淀，如有沉淀，可用枪头轻轻吹打至完全溶解。向蛋白浓缩液中加入适量25mM NH4HCO3稀释至尿素终浓度低于IM，按胰蛋白酶和蛋白的质量比为1:50加入胰蛋白酶，同时加入10%ACN，37摄氏度酶解14h后补加适量胰蛋白酶，2h后加入TFA酸化终止反应，除盐冻干后将生物素反应后的肽段重溶于10ul 20mM NaH2P04,0.15M NaCl(PH7.4)的缓冲液，向已经平衡好的Streptavidin Beads 6FF层析柱(填料按2nmol of D-b1tin/15ul的载量填充)中缓慢加入肽段样品，在重力作用下平衡，非生物素肽段缓慢流出，用ddH20洗涤一次，合并洗涤液和流出液，除盐、冻干，然后进行LC-MS质谱分析。
【主权项】
1.一种二 /三甲基化肽段富集和质谱分析的方法，其特征在于，利用生物素化试剂(EZ-NHS-b1tin)基团能够与未修饰(KmeO)或者单甲基化(Kmel)(记为KmeO/1)修饰的赖氨酸发生特异性反应而不会与二、三甲基化(Kme2/3)修饰的赖氨酸反应的特点，通过亲和素偶联的琼脂糖微球去除KmeO/1修饰的赖氨酸肽段，对Kme 2/3修饰的赖氨酸肽段进行富集;具体步骤为: (1)蛋白生物素化修饰:基于N-羟基琥珀酰亚胺与赖氨酸侧链氨基的高效反应，采用生物素化试剂(EZ-NHS-b1tin)，通过化学反应将生物素基团引入赖氨酸KmeO/Ι上，实现蛋白样品中赖氨酸KmeO/1的高效生物素化修饰； (2)蛋白沉淀:向经步骤(I)生物素化修饰的蛋白样品加入丙酮，过夜，沉淀蛋白，同时去除过量的生物素化试剂； (3)蛋白酶解:向经步骤(2)处理的蛋白中加入胰蛋白酶，胰蛋白酶和蛋白的质量比1:40-60，充分混合，35-39摄氏度酶切14-16小时，使蛋白完全酶解成氨基酸长度在10-20之间的的肽段； (4)亲和素去除生物素修饰肽段:用缓冲液稀释肽段至1-1.5ml，用亲和素偶联的琼脂糖微球为吸附剂，利用亲和素和生物素之间的高亲和能力，将生物素化的KmeO/Ι吸附到亲和素偶联的琼脂糖微球上，亲和吸附过程在2-6摄氏度条件下进行，时间2-4小时，充分去除发生生物素修饰的KmeO/Ι修饰肽段； (5)质谱分析:600-1200g离心后取上清，通过除盐柱富集上清中的肽段，冻干，然后进行质谱检测。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(I)中所述蛋白样品用缓冲液提取细胞全蛋白得到，蛋白样品浓度为lug/yL~ 5ug/yL;所述采用生物素化试剂(EZ-NHS-b1tin) ， 通过化学反应将生物素基团 引入赖氨酸KmeO/Ι上，是在蛋白样品中，加入5-30mM的碳酸氢氨，同时加入等体积5-30mM的EZ-NHS-b1tin，在35-39摄氏度下避光混合，使样品中的KmeO/1修饰的赖氨酸被充分被生物素化。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中蛋白沉淀的操作过程为:在向所述蛋白样品中加入5-10倍体积的预冷丙酮，-10-30摄氏度过夜；11000-15000g离心20-40分钟后得到蛋白沉淀，用预冷丙酮洗2-4次，完全去除生物素化试剂。4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)中，先用6-10M尿素重溶步骤(2)中得到的蛋白沉淀用缓冲液稀释至0.5-2M尿素;然后加入胰蛋白酶，进行酶解。5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(4)中，琼脂糖微球材料与所富集肽段的体积质量比为50-200ul/lmg。6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(4)中，先对亲和素偶联的琼脂糖微球用缓冲液进行清洗，重复2-3次。7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(5)的操作过程为:合并步骤(4)中所得到的上清和清洗液;然后除盐、冻干;再重溶于0.05-0.2%FA中；最后进行LC-MS/MS分析。
【专利摘要】本发明属蛋白质分析技术领域，具体为一种二/三甲基化（Kme2/3）修饰肽段富集和质谱分析的方法。本发明方法包括：对蛋白上未修饰（Kme0）或者单甲基化（Kme1）修饰的赖氨酸进行衍生化使其带上生物素标记，再将蛋白酶解成肽段后，再加入亲和素偶联的琼脂糖微球，通过生物素和亲和素之间的高特异和高亲和作用，除去Kme0/1肽段，在上清中保留Kme2/3修饰肽段，最后利用除盐柱捕获上清中的肽段，送入质谱分析质谱分析Kme2/3修饰肽段。本发明方法首次实现对Kme2/3修饰肽段的化学富集，能显著地提高Kme2/3修饰肽段的分析质谱选择性，并且具有特异性强、重现性好、步骤简单、操作方便等特点。
【IPC分类】G01N27/62, C07K1/22
【公开号】CN105693816
【申请号】CN201610151772
【发明人】陈佳佳, 胡亚君, 徐莹, 金红, 杨芃原
【申请人】复旦大学
【公开日】2016年6月22日
【申请日】2016年3月17日