家畜s2疫苗免疫与羊/牛种布鲁氏菌感染的ielisa检测试剂的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及基因工程及免疫学领域，具体地说，设及一种家畜S2疫苗免疫与羊/牛 种布鲁氏菌感染的IELISA检测试剂。
【背景技术】
[0002] 布鲁氏菌病(brucellosis)是由布鲁氏杆菌(brucella)引起的全世界范围内广泛 流行的人兽共患，OIE归为乙类传染病。布鲁氏菌分屯个种，牛种（B.abodus)、羊种 (B.melitensis)、猪种（B. suis)、犬种（B. cains)、绵羊种（B.ovis)、森林鼠种布鲁氏菌 (B.neotomae)、海洋哺乳动物布鲁氏菌(B.meris)，羊种、牛种为主要流行病原种类，其中羊 种毒力最强，危害最大。布鲁氏菌病传染方式为接触患病动物、未消毒的肉制品、乳制品，也 可经呼吸道、消化道及皮肤黏膜等组织器官侵入体内引起感染。
[0003] 布鲁氏菌一旦进入宿主体内，细菌侵入血液和淋己管，繁殖并被巨隧细胞吞隧。家 畜感染布鲁氏菌病常见的症状有母畜流产、公畜睾丸肿大、严重者肝脏和脾脏等内脏肿大。 家畜感染布鲁氏菌多W淘汰为主，为此，严重影响了畜牧业的健康发展，而且威胁到了人类 的健康。
[0004] 近几年来，我国布鲁氏菌病的流行较为严重，已经受到各级政府部口、科研工作者 和广大人民群众的广泛关注。传统疫苗很难达到理想的保护免疫水平，并且目前的诊断方 法无法辨别布鲁氏菌疫苗免疫与自然感染，而近年来研究的一些鉴别诊断方法不能很好地 在生产实践中鉴别S2疫苗免疫与羊/牛种布鲁氏菌感染，因此，很难做到在免疫畜群中净化 布鲁氏菌自然感染病畜。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是提供一种家畜S2疫苗免疫与羊/牛种布鲁氏菌感染的IELISA检测 试剂。
[0006] 本发明的另一目的是提供用于鉴别家畜S2疫苗免疫与羊/牛种布鲁氏菌感染的 IELISA检测试剂盒。
[0007] 为了实现本发明目的，本发明针对市场上普遍使用的布鲁氏菌主流疫苗一S2疫 苗，对S2疫苗进行全基因组测序及生物信息学分析。找出与羊/牛种布鲁氏菌相比较S2疫苗 株的特有基因，基因重组表达后，筛选出具有免疫原性的抗原蛋白，建立布鲁氏菌S2疫苗免 疫与羊/牛种布鲁氏菌感染的IELISA鉴别方法。
[000引本发明首先提供GL_0002189抗原蛋白，其氨基酸序列如Seq ID No.l所示，或该序 列经替换、缺失或添加一个或几个氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。该化_ 0002189抗原蛋白由52疫苗株基因61_0002189(569 10齡.2)编码。
[0009] 本发明还提供用于扩增S2疫苗株基因 GL_0002189的特异性PCR引物。
[0010] 本发明还提供所述GL_0002189抗原蛋白在制备家畜S2疫苗免疫与羊/牛种布鲁氏 菌感染的IELISA检测试剂中的应用。
[0011] 本发明中设及的布鲁氏菌自然感染是指羊种和/或牛种布鲁氏菌自然感染。
[0012] 本发明还提供一种鉴别家畜S2疫苗免疫与羊/牛种布鲁氏菌感染的胶体金试纸 条，所述试纸条上包被有GL_0002189抗原蛋白W及布鲁氏菌BP26蛋白，或者它们的N端或C 端融合有化S标签的重组蛋白。
[0013] 本发明还提供含有上述IELISA检测试剂的家畜S2疫苗免疫与羊/牛种布鲁氏菌感 染的IELISA检测试剂盒。
[0014] 本发明进一步提供一种鉴别家畜S2疫苗免疫与羊/牛种布鲁氏菌感染的方法，提 取待测家畜的血清，用上述IELISA检测试剂进行检测，比较两种抗原蛋白的阳性检出率。如 果IELISA检测结果为两种抗原蛋白均为阳性，则待测家畜血清中含有S2疫苗免疫产生的抗 体;如果GL_0002189抗原蛋白检测为阴性，BP26蛋白检测为阳性，则待检家畜为羊种或牛种 布鲁氏菌自然感染。上述鉴别方法同样适用于感染布鲁氏菌的人血清的检测。
[0015] 实验表明，本发明建立的IELISA鉴别方法具有较好的重复性及较高的特异性和敏 感性。
[0016] 本发明提供的IELISA检测试剂能鉴别布鲁氏菌中毒力强、危害大的主要流行病 原一羊种/牛种布鲁氏菌及市场上普遍使用的主流疫苗一S2疫苗。因此，能够在短时间内鉴 别家畜血清中疫苗免疫与自然感染抗体，解决免疫畜群中疫苗抗体干扰布病检测(假阳性） 和畜群净化的难题。不仅可带来社会经济效益，而且可为净化畜群中的布鲁氏菌做出贡献。
【附图说明】
[0017]图访本发明实施例1中布鲁氏菌S2疫苗株基因化_0002189的PCR检测结果;其中， M为DNA Marker DL2000;1为S2疫苗;2为羊种菌;3为牛种菌。
[001引图2为本发明实施例1中基因 GL_0002189及BP26的PCR扩增电泳图；其中，M为DNA Marker DL2000; 1为基因 GL_0002189; 2为基因 BP26; 3为空白对照。
[0019] 图3为本发明实施例1中重组克隆质粒GL_0002189双酶切鉴定结果；其中，M为DNA Marker DL2000; 1-3为基因 GL_0002189。
[0020] 图4为本发明实施例1中重组克隆质粒BP26双酶切鉴定结果;其中，M为DNA Marker DL2000;l-3 为基因 BP26。
[0021] 图5为本发明实施例1中重组表达质粒GL_0002189双酶切鉴定结果;其中，Ml为DNA Marker DL2000;M2为DNA Marker DL15000; 1-3为基因 GL_0002189。
[0022] 图6为本发明实施例1中重组表达质粒BP26双酶切鉴定结果；其中，Ml为DNA Marker DL2000; M2为DNA Marker DLl 5000; 1-3为基因 BP26。
[0023] 图7为本发明实施例1中重组表达菌BL21 (祀TGL_0002189)诱导时间优化SDS-PAGE 电泳结果;其中，M为蛋白质marker; 1为化21空菌;2为祀T30诱导前;3为祀T30诱导后;4-9为 祀TGL_0002189 Oh、化、2h、化、地、化诱导表达菌。
[0024] 图8为本发明实施例1中重组表达菌化21(pETBP26)诱导时间优化SDS-PAGE电泳结 果；其中，M为蛋白质marker ;1为化21空菌；2为PET30诱导前；3为PET30诱导后；4-9为 PETBP26 Oh、化、2h、：3h、4h、化诱导表达菌。
[00巧]图9为本发明实施例1中重组表达菌化21(pET GL_0002189)诱导剂浓度优化SDS-PAGE电泳结果；其中，M为蛋白质marker; 1为化21空菌；2为祀T30诱导前；3为祀T30诱导后； 4-9为IPTG终浓度为0.05mM、0. lmM、0.2mM、0.5mM、1.0mM、2. OmM时化21 (pET GL_0002189)诱 导表达。
[0026] 图10为本发明实施例1中重组表达菌化21 (PETBP26)诱导剂浓度优化SDS-PAGE电 泳结果；其中，M为蛋白质marker; 1为化21空菌；2为PET30诱导前；3为PET30诱导后;4-9为 IPTG 终浓度为 0.05111]\1、0.1111]\1、0.2111]\1、0.5111]\1、1.0111]\1、2.0111]\1时化21(9618?26)诱导表达。
[0027] 图11为本发明实施例1中重组表达菌化21(pETGL_0002189)诱导剂溫度优化SDS-PAGE电泳结果；其中，M为蛋白质marker; 1为化21空菌；2为祀T30诱导前；3为祀T30诱导后； 4-6为化21(祀161_0002189)25°(：、30°(：、37°(：诱导表达。
[0028] 图12为本发明实施例1中重组表达菌化21 (PETBP26)诱导溫度优化SDS-PAGE电泳 结果;其中，M为蛋白质marker; 1为化21空菌；2为祀T30诱导前；3为祀T30诱导后;4-6为化21 (祀 TBP26)25°C、30°C、37°C 诱导表达。
[0029] 图13为本发明实施例1中重组菌在不同溫度下生长情况。
[0030] 图14为本发明实施例1中两个重组蛋白表达形式的SDS-PAGE电泳检测结果;其中， M为蛋白质marker; 1为化21 (pETGL_0002189)菌体裂解物上清;2为化21 (祀TGL_0002189)菌 体裂解物沉淀;3为化21 (PETBP26)上清;4为化21 (PETBP26)菌体裂解物沉淀。
[0031] 图15为本发明实施例1中两个纯化的重组蛋白纯化的SDS-PAGE电泳检测结果;其 中，M为蛋白质marker;l为纯化的重组蛋白GL_0002189;2为纯化的重组蛋白BP26。
[0032] 图16为本发明实施例1中重组蛋白化S标签Western-bloting检测结果；其中，M为 蛋白质marker; 1 为化21 (pETGL_0002189); 2为化21 (PETBP26)。
[0033] 图17