特异性靶向her2蛋白的多肽及其应用

文档序号:9919330阅读:1332来源:国知局
特异性靶向her2蛋白的多肽及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明设及药物化学领域,具体地说,设及特异性祀向肥R2蛋白的多肤及其应用。
【背景技术】
[0002] 根据《世界癌症报告》预测全球癌症病例将呈现迅猛增长态势,由2012年1400万 人,逐年递增至2025年1900万人,至2035年将达到2400万人。2012年全世界共新增1400万癌 症病例并有约820万人因癌症死亡。其中,中国新增307万癌症患者并有约220万人因癌症死 亡,分别占全球总量的21.9%和26.8%。世界范围内引起癌症死亡最常见的癌症类型有:肺 癌(159万死亡)、肝癌(74.5万例死亡)、胃癌(72.3万例死亡)、大肠癌(69.4万例死亡)、乳腺 癌(52.1万例死亡)、食管癌(40.0万例死亡)。其中,乳腺癌高居女性常见癌症首位。国际癌 症研究机构根据现有数据预计,受人口增长和老龄化影响,发展中国家的癌症数量不断攀 升,全球约60%病例发生在非洲、亚洲和中美洲及南美洲地区,并且占全世界癌症死亡数 70%左右。
[0003] 目前恶性肿瘤的治疗方法主要有手术治疗、化疗、放疗=种,其中化疗是目前治疗 肿瘤及某些自身免疫性疾病的主要手段之一,但在治疗中,患者普遍有明显的恶屯、呕吐等 副作用,给患者带来不适感。在杀伤肿瘤细胞的同时,也杀伤了人体正常细胞,毒副作用大。 因此,祀向抗肿瘤药物及分子探针研究势在必行。
[0004] 癌症祀向治疗成功的前提是找准治疗的祀点。世界范围内约30%乳腺癌患者中伴 有肥R2(人表皮生长因子受体2,又名化bB2)蛋白高表达。皿R2蛋白是一个18化化的跨膜糖 蛋白受体酪氨酸激酶,定位于细胞膜,具有胞外配体结合区,单跨膜区和胞内酪氨酸激酶活 性区。皿R2参与信号转导途径,激活后引起憐酸化激酶级联反应,导致细胞生长和分化。乳 腺癌、卵巢癌,胃癌和子宫等多种肿瘤中都有皿R2的过度表达。肥R2已经成为治疗癌症的重 要祀标。
[0005] 多肤易于大量合成,分子量小,组织渗透性强,同时可防止网状内皮系统的非特异 性摄取。此外,多肤可通过反复的优化修改在体内使用。在肿瘤祀向疗法中,多肤类药物及 诊断探针显示出很强的优越性,是抗体的一种有效替代物。在应用方面,多肤与标记物如放 射性同位素或巧光分子的配合,可作为探针应用于分子成像;多肤和抗癌药物联合可用于 肿瘤祀向治疗。因此研发有价值的活性多肤已成为癌症诊断与治疗面临的重要任务。
[0006] CN104130315A公开了一种特异祀向皿R2蛋白的多肤,所述多肤如W下通式所示: XiX 巧试 4X5X6X7RX8YWX9X10X11X1 巧 13X14X15X16X17RX18X19X20X21YX22,能对 HER2 阳性细胞起祀向作 用。本发明的多肤和上述多肤与HER2蛋白亲和性相似,但作用位点不同,两者可W在肿瘤诊 断和治疗中联合使用。

【发明内容】

[0007] 本发明的目的是提供一种特异性祀向肥R2(人表皮生长因子受体2)蛋白的多肤。 [000引本发明的另一目的是提供所述多肤在制备祀向皿R2抗肿瘤药物或显像剂中的应 用。
[0009]为了实现本发明目的,本发明提供的特异性祀向皿R2蛋白的多肤是基于W下模板 设计的:EWVADVNPNSGGSIYNQRFK(帕妥珠单抗第46-65位氨基酸)。该模板可与肥R2蛋白胞外 区第II结构域相结合,是帕妥珠单抗发挥作用的关键位点。
[0010] 本发明多肤的氨基酸序列为:E W V A D Xi N P N拉X3 X4 Xs Xs X7 N Xs X9 Xio K。
[0011]其中,E为谷氨酸,W为色氨酸,V为鄉氨酸,A丙氨酸,D为天冬氨酸,N为天冬酷胺,P 为脯氨酸,S为丝氨酸,G为甘氨酸,I为异亮氨酸,Q为谷氨酷胺,R为精氨酸,F为苯丙氨酸,K 为赖氨酸;Xi为极性氨基酸,优选为酪氨酸和组氨酸;X2为非极性氨基酸,优选为脯氨酸、甲 硫氨酸和鄉氨酸;X3为非极性氨基酸,优选为甲硫氨酸;X4为非极性氨基酸,优选为丙氨酸; Xs为芳香族或碱性氨基酸,优选为苯丙氨酸和组氨酸;Xs为碱性氨基酸,优选为精氨酸;X7为 非极性氨基酸,优选地为色氨酸;Xs为非极性氨基酸,优选为苯丙氨酸;X9为非极性氨基酸或 非电荷极性氨基酸,优选为丙氨酸、色氨酸、酪氨酸和谷氨酷胺;Xio为碱性氨基酸,优选为精 氨酸。
[0012] 本发明所述多肤通过突变上述模板氨基酸序列获得,可与肥R2胞外区第II结构域 相结合,能够特异结合人肥R2高表达阳性乳腺癌细胞,且亲和性比模板高。
[0013] 优选地,所述多肤的氨基酸序列选自SEQ ID N0:l-36任一所示的氨基酸序列。
[0014] 更优选地,所述多肤的氨基酸序列为SEQ ID NO: 1或2。
[0015] 本发明还提供编码所述多肤的基因或DNA片段。
[0016] 本发明还提供含有至少一个拷贝的编码所述多肤的基因或DNA片段的载体。
[0017] 本发明还提供含有上述载体的宿主细胞或工程菌。
[0018] 本发明还提供一种药物组合物,所述药物组合物是由上述多肤与能杀伤癌细胞的 制剂相缀合或混合而成。
[0019] 优选地,所述制剂为能杀伤癌细胞的化学药物、生物药物、纳米药物、放射性药物、 光热治疗或光动力治疗药物或包裹上述药物的载体等中的至少一种。
[0020] 更优选地,所述制剂为烧化剂、抗代谢药物、抗肿瘤天然药物、抗肿瘤抗生素、激 素、金属络合物或肿瘤放射祀向标记物等中的至少一种。
[0021] 更优选地,所述载体为纳米材料,脂质体或油性化合物等中的至少一种,或者由多 种油性化合物组成的混合物,从而保证所述多肤可W使缀合后生成的药物化合物在机体内 更稳定地被运输到祀细胞。
[0022] 本发明还提供一种药物组合物,所述药物组合物是由上述多肤与显像剂相缀合或 混合而成。
[0023] 优选地,所述显像剂为放射性核素、放射性核素标记物或分子影像剂等中的至少 一种。
[0024] 本发明进一步提供所述多肤在制备用于治疗、预防或诊断癌症的药物或显像剂中 的应用。
[0025] 所述癌症为肥R2过表达的癌症。优选地,所述癌症为乳腺癌、胃癌、白血病、膀脫癌 或子宫颈癌或鼻咽癌等中的任意一种。
[0026] 本发明提供的多肤具有祀向肥R2蛋白的作用,可作为先导分子增加药物或载有药 物的载体(如纳米材料、脂质体等)在皿R2阳性细胞中的含量,再添加药学上可接受的辅料 或佐剂制成新型的更有效的祀向抗癌药物。
[0027] 本发明具有W下优点:
[0028] (一)本发明的多肤能对皿R2阳性细胞起祀向作用,选择性强,所述多肤可采用化 学合成的方法制备获得,纯度高,分子量小,特异性强,无免疫原性,安全可靠;
[0029] (二)本发明的多肤能结合人皿R2阳性乳腺癌细胞,亲和性较高,与皿R2低表达人 乳腺癌细胞468细胞的结合作用甚微,表明将多肤作为特异祀向肥R2的分子,对肥R2有选择 性结合作用;
[0030] (S)本发明的多肤具有祀向皿R2阳性肿瘤细胞的特性,作为祀向多肤,可用于肿 瘤的祀向治疗或祀向肿瘤的分子成像与诊断。
【附图说明】
[0031] 图1为本发明实施例2中利用免疫巧光法检测FITC标记的SEQ ID NO: USEQ ID NO : 2多肤对人HER2阳性乳腺癌细胞(SKBR3细胞系)的结合作用结果;其中,细胞核用 hoechst试剂染色;A-C是SEQ ID N0:1多肤和hoechst处理过的细胞,其中A为细胞核,B为 SEQ ID NO: 1多肤的结合位点,主要存在于细胞膜,C为A-B的叠合图;D-F是SEQ ID NO:2多 肤和hoechst处理过的细胞,其中E为为细胞核,F为SEQ ID NO: 2多肤的结合位点,主要存在 于细胞膜,F为D-E的叠合图。
[0032] 图2为本发明实施例3中利用免疫巧光法检测FITC标记的SEQ ID NO: USEQ ID N0:2多肤对人皿R2阴性乳腺癌细胞(468细胞系)的结合作用结果;其中,细胞核用hoechst 试剂染色;A-C是SEQ ID NO: 1多肤和hoechst处理过的细胞,其中A为细胞核,B为SEQ ID N0:1多肤的结合位点,主要存在于细胞膜,C为A-B的叠合图;D-F是SEQ ID N0:2多肤和 hoechst处理过的细胞,其中E为为细胞核,F为SEQ ID NO: 2多肤的结合位点,主要存在于细 胞膜,F为D-E的叠合图。
[0033] 图3为本发明实施例4中利用表面等离子共振(SPR)方法检测SEQ ID NO: I(A)和 SEQ ID NO: 2(B)对不同浓度的人肥R2蛋白的结合作用结果。
[0034] 图4为本发明实施例5中采用小鼠活体成像方法检测SEQ ID NO: 1和2多肤对皿R2 蛋白的亲和性和特异性结果。
【具体实施方式】
[0035] W下实施例用于说明本发明,但不用来限制本发明的范围。若未特别指明,实施例 中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段,所用原料均为市售商品。
[0036] 实施例1特异性祀向肥R2蛋白的多肤的合成
[0037] 1、实验仪器与材料
[0038] 二甲基甲酯胺(DMF),赃晚,树脂,二氯甲烧(DCM),巧S酬反应试剂(巧S酬,维C, 苯酪),四甲基脈六氣憐酸盐化BTU),六氨化晚(赃晚),S异丙基硅烷(TIS),乙二硫醇 化DT),无水乙酸,S氣乙酸(TFA),N-甲基吗嘟(NMM),甲醇,各种氨基酸,多肤固相合成管。
[0039] 2、溶液配制
[0040] 脱保护液--六氨化晚:DMF = 1:4
[0041] 反应液--NMM: DMF = 1:24
[0042] 裂解液--1尸4(92.5%)、1'15(2.5%)、邸1'(2.5%)、出0(2.5%)
[0043] 巧S酬测试液一巧S酬:维C:苯酪=1:1:1
[0044] 3、实验步骤
[0045] 称量树脂并投入到多肤固相合成管(W下简称反应器)中,加入适量的DMF溶胀半 小时W上。抽掉DMF,用脱保护液进行Fmoc去保护反应,置于摇床上10分钟。抽掉去保护液, 用DMF、DCM洗涂3次,从反应器中取少量树脂(约5~IOmg)于试管中,用乙醇洗涂2次,巧S酬 法检测并记录颜色,准备投料,进入氨基酸缩合反应。分别按照SEQ ID N0:l-36任一所示的 氨基酸序
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