一种两性离子型聚合物微球及其制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物分离和生物医学工程领域，具体设及一种两性离子型聚合物微球 及其制备方法。
【背景技术】
[0002] 免疫检测技术是一种基于抗原和抗体特异性作用的生化检测方法，其发展来源于 19世纪50年代发明的免疫比浊检测技术。免疫比浊检测可W利用抗原抗体反应后形成的 沉淀或浊度来进行直接测定，但在临床检验中，某些待测物在标本中的含量很低（甚至只 有纳克级别）。因此为了寻找增加敏感度的方法，将检测试剂中的抗原或抗体用可微量测定 的物质加 W标记，通过测定标记物来提高敏感度。相继出现的标记免疫分析技术如：酶免疫 检测、化学发光免疫检测和巧光免疫检测等技术，其标记物分别为酶、化学发光物质和巧光 物质，运样灵敏度可W提高数百至数千倍，检测下限可W到达纳克级别。由于抗体抗原之间 特异性的作用，免疫检测常应用于复杂体系中某中物质的检测，相比传统的化学检测方法， 更加快捷，准确。
[0003] 酶免疫检测可分为均相和非均相两种类型。均相酶免反应中游离的和结合的标记 物的分离比较困难，一般在不分离的情况下直接测定标记物，所W均相酶免疫检的误差可 能会比较大，在临床检验中较少应用。非均相EIA则利用了固相载体，可W对游离的和结合 的标记物进行分离，运样检测的时候干扰就会比较小。但非均相酶免疫检测由于其操作上 的复杂性阻碍了酶免疫检测的发展和应用。
[0004] 近年来，随着纳米科技的高速发展，其在医药、能源、环境、生物技术等多个领域应 用越来越广泛。纳米材料的小尺寸效应和表面效应使得纳米材料具有区别于宏观材料所独 特的性质。具中W聚合物纳米微球为例，一方面由于表面具有丰富的可修饰基团，便于与抗 体，蛋白质，W及祀向配体的结合，另一方面作为固相载体，聚合物纳米微球的某些独特性 质对于免疫反应的信号放大、便于分离清洗W及在机器上实现全自动化起到了突出作用， 其在生物医学领域的应用十分具有代表性。 阳〇化]例如胶乳增强免疫比浊法利用粒径均匀的聚合物胶乳颗粒作为固相载体，使其吸 附特异性抗体，制成免疫性微球后，与传统免疫比浊法相比，解决了当检测少量的抗原抗体 时，其复合物极难形成浊度变化的问题。运是因为当结合了抗体的微球与抗原发生免疫反 应时，不溶性抗原抗体复合物快速在胶乳表面形成，由于聚合物胶乳复合物的粒径要比单 纯抗原抗体复合物的粒径大得多，在可见光范围内，比对反应前后的溶液浊度变化，既吸光 度的变化。胶乳增强免疫比浊法增强了免疫反应的反应信号，其吸光度的变化在一定范围 内和被测物的含量成正比，由此可计算被测物含量。
[0006] 再如化学发光免疫检测的原理是利用小分子叮晚醋等标记物的氧化还原反应，发 射的光子被光信号计量装置接收后，进行数字处理，计算出标记物的相应发光值。而运一检 测系统中的关键组分一-聚合物磁性微球承载了免疫反应固相载体的作用W及快速分离 的重要作用。首先抗体结合在聚合物磁性微球上，由于免疫反应的高特异性，将待检测物从 待检测样本复杂的物质构成中分离捕获出来，当加入带有标记物的二抗时，在磁性微球上 形成两株抗体夹待测物运一复合物形式，同时由于微球的超顺磁性，在外加磁场下可快速 分离，W去除溶液中游离的带有标记物的二抗，从而构建出待测物质和标记物的关系，也将 具体数字化的发光值与待测物含量联系起来。
[0007] 最后巧光增强免疫层析是近年来出现的一种新型检测方法，其方法是巧光（包括 稀±整合物、有机巧光染料等）聚合物微球上定向偶联抗体片段，通过毛细作用，样本中的 抗原与巧光微球表面抗体结合后，从而带动继续在膜上延展，在检测线附近与固定的二抗 形成巧光微球-抗体-抗原-二抗复合物，直接检测巧光微球的巧光，从而确定待测物中抗 原的含量。要求巧光微球可W免受一般溶剂的干扰，巧光发射强而稳定，巧光微球标记的抗 体在干燥溶解后仍然可W保持其巧光活性、生物活性和单分散的胶体状态。巧光微球由于 可W实现很高的F/P值，对于实现高灵敏的巧光免疫分析提供了很好的应用前景。
[0008] W上=种方法均采用的聚合物微球通常是非常疏水的材料，直接应用会不可避免 存在蛋白质在材料表面吸附的问题，非特异性的蛋白吸附会造成试剂聚集，增加反映的本 底值，导致反应基线的波动，严重时甚至会造成假阳性或者假阴性的结果，直接影响到检测 的可信度，形成误诊或者漏诊等危害。因此，降低聚合物微球试剂非特异性吸附的研究越来 越受到重视。提高胶乳微球试剂的稳定性，W防止其聚集，降低其非特异性吸附并减少其在 血清或者全血中与样品组分的非特异性互相作用，是如今体外诊断测定中的一个挑战。
[0009] 疏水相互作用和静电场被认为是非特异性吸附的两大起因。疏水相互作用是通 过疏水物的非极性疏水基与水相互排斥作用而发生的。运种作用使疏水基相互靠犹，当蛋 白质分子与聚合物基质的作用时，会影响蛋白质的=维结构，使其变得结构松散，导致蛋白 质在基质表面发生构型的延展，甚至失活。静电场的原理可W简单描述为"同性相斥，异性 相吸"，因此静电场对吸附的作用取决于蛋白质的等电点、体系的抑和聚合物表面的电荷情 况。另外聚合物表面也可W与杂质发生非特异性的覆盖结合，运也是非特异性吸附的重要 起因。
[0010] 两性离子聚合物是带有等量正负电荷的聚合物，两性离子聚合物通过离子溶剂化 作用，与水分子具有更强的结合能力。W细胞膜为例，其主要成分是憐脂类双亲性分子，在 水溶液中，细胞膜可W有效保持细胞表面形成一层紧密的结合水，并不与杂蛋白结合。憐酸 胆碱是组成细胞膜的基本单元的亲水基端，是细胞外层膜中的最外层基团，具有电中性、高 亲水性、无毒和在生理抑值下稳定的特性。常见的两性离子聚合物单体有2-甲基丙締酷 氧基憐酸胆碱（MPC)、横酸基甜菜碱和簇酸基甜菜碱等，使用运类物质修饰材料后，由于热 力学作用使双亲性分子的疏水尾部与水的作用最小，亲水基团最大限度地暴露出来与水接 触，从而可W形成一层类似膜结构。同时，由于它们都是是电中性的，在一个给定的结构中 正电荷和负电荷平衡，导致材料表面由于静电场的吸附也减少。将两性离子通过共聚引入 疏水性的聚合物微球上W改善其亲水性和降低其非特异性结合的方法在现在技术中还没 有被报道过。
【发明内容】
[0011] 本发明的目的在于克服现有技术中的不足，提供一种两性离子型聚合物微球及其 制备方法，将两性离子通过共聚引入疏水性的聚合物微球上W改善其亲水性和降低其非特 异性结合，同时在此基础上引入长链官能团分子，通过化学键偶联分子探针，一方面共价结 合使得的复合物更加稳定，同时长链的官能团可W减少偶联时空间位阻，稳定结合的生物 分子活性。
[0012] 本发明的第一个方面是提供一种两性离子型聚合物微球，包括载体和固载在载体 上的功能性配基，所述载体为疏水性聚合物微球，其中，所述载体上还固载有两性离子基 团，所述两性离子基团同时含有阳离子基团和阴离子基团。
[0013] 优选地，所述阳离于基团为胺基盐离子、季锭或化晚阳离子等，所述阴离子基团为 簇酸基、横酸基、憐酸基或硫酸醋基等。
[0014] 进一步优选地，所述两性离子基团为憐酸基类两性离子单体、横酸基类两性离子 单体和簇酸基类两性离子单体中的一种或多种。
[0015] 更进一步优选地，所述两性离子基团为2-甲基丙締酷氧乙基憐酸胆碱、横酸基甜 菜碱（例如N，N-二甲基-N-甲基丙締酷胺基丙基-N-丙烷横酸内盐）和簇酸基甜菜碱（例 如N，N-二甲基-N-甲基丙締酷氧乙基-N-乙酸内盐）。
[0016] 优选地，所述功能性配基为具有间隔臂的官能团单体。一方面引入的官能团结构 为共价结合提供活性位点，官能团种类和含量可根据实际需要进行调节，另一方面其长链 结构可避免两性离子型憐酸胆碱单体对官能基团的遮蔽，减少偶联时的空间位阻，为抗体 抗原的结合提供了有利条件。
[0017] 进一步优选地，所述功能性配基为带有簇基的长链聚合物单体，例如带有径基的 聚合物单体（如甲基丙締酸径乙醋，甲基丙締酸聚乙二醇单醋等）与带有酸酢的分子（如 马来酸酢，下二酸酢等）反应，径基与酸酢形成醋键后，再裸露出另一分子的簇基，再通过 共聚引入到聚合物微球结构中。
[0018] 优选地，载体上功能性配基的有效载入量为100~1000 y mol/g