一株粘质沙雷氏菌及其在抑制肿瘤中的应用
【技术领域】
[0001] 本发明设及一株粘质沙雷氏菌，及其在抑制肿瘤中的应用，属于生物技术领域。
【背景技术】
[0002] WHO《全球癌症报告2014》数据显示，2012年全球癌症患者和死亡病例都在增加，新 增病例近一半出现在亚洲，其中大部分在中国、印度。在肝、食道、胃和肺等4种恶性肿瘤中， 中国新增病例和死亡人数均居世界首位。手术治疗有效，但多数患者就诊时已经错过手术 时机，只能依赖化疗、放疗，疗效不佳。寻找新机制的治疗方法是领域内不懈的追求。二十世 纪八十年代，有人发现细菌感染者的皮肤癌、淋己癌和白血病患病几率较低，且发现运些细 菌注入动物体内会导致肿瘤萎缩，从此细菌及其产物治疗肿瘤成为热口课题之一。
[0003] 沙雷氏菌是众多具有抑瘤效果的细菌之一。有关沙雷氏菌治疗恶性肿瘤实验研究 和临床研究均不乏报道，1997年斬小青等发现粘质沙雷氏菌S311抑制小鼠艾氏腹水癌，小 鼠 P388白血病，小鼠 B16黑色素瘤肺转移和小鼠 Lewis肺癌肿瘤细胞;2003年斬小青采用小 鼠模型研究粘质沙雷氏菌苗的抑制肿瘤的效果，提示腹腔注射可明显抑制小鼠 HCA的原发 灶和转移灶、抑制肿瘤转移和复发。1993年化vas HF首先将粘质沙雷氏菌复方制剂用至临 床11例难治性恶性肿瘤，发现1例轻微反应，1例部分反应，4例病情暂时稳定，5例病情进展， 其中一例艾滋病Kaposi's肉瘤患者病情得到改善。有关粘质沙雷氏菌治疗肿瘤的报道资料 国内多于国外，1999年徐永茂等通过胸、腹腔内注射观察了粘质沙雷氏菌S311的疗效，发现 在5例癌性胸水患者中4例完全缓解，在9例癌性腹水患者中5例完全缓解。2000年顾建庆将 粘质沙雷氏菌S311制剂进行了 I期临床试验，结果提示制剂对胸水有效。2000年张巧平临床 资料报道粘质沙雷氏菌S311制剂对恶性胸腔积液有效率为88.6%，完全缓解率48.6%，尤 其对少、中量积液疗效较好。2001年朱允中在n临床试验中对241恶性胸水做了观察，总有 效率92.1 %，且部分胸水癌细胞转阴。2002年茅国新报道粘质沙雷氏菌制剂控制癌性胸腔 积液有效率达90.6 %，生活质量改善率为84.4%，0.5年、1年、1.5年生存率分别是:93.8%、 62.5 %、40.6%，毒副反应为胸痛（18.8 % )和发热（15.6 % )。2007年王庆蓉对18例脑神经胶 质细胞瘤术后患者进行观察，采用化疗囊瘤内注射，发现1、2、4年的生存率分别为72.2%、 55.68 %、55.68%，高于对照组。2002年何晓文采用改良端粒重复序列扩增(TRAP)-银染方 法检测20例膀脫移行上皮细胞癌肿瘤组织粘质沙雷氏菌制剂灌注前后的端粒酶活性，发现 粘质沙雷氏菌制剂可使肿瘤组织端粒酶活性降低。
[0004] 有关沙雷氏菌的抑瘤现象已被诸多实验资料证实，但是其疗效机制至今研究不 明；综合诸多资料，其抑瘤机制可归纳为两个主要途径，抑瘤机制之一是粘质沙雷氏菌胞壁 含有多种对肿瘤细胞直接细胞毒活性，具有直接杀伤肿瘤细胞的作用，比如1994年赵虎等 人发现粘质沙雷氏菌能够直接杀伤体外培养的SMMC-7721细胞株、HeLa细胞株、KM3细胞株、 SO肉瘤细胞株等肿瘤细胞，对正常组织细胞无明显的影响作用。还有些人认为粘质沙雷氏 菌抑制肿瘤的疗效与其在28°C产生的灵菌红素有关，且进行了提纯，新合成的PG衍生物 GX15-070,作为多种癌症的治疗药物，已进入临床n期研究。根据NIC公布的数据，灵菌红素 对人60个常见癌细胞株的平均IC50值约为2.化M，灵菌红素NSC编号为47147-F。抑瘤机制之 二则认为粘质沙雷氏菌的抑瘤效果与免疫调节机制有关。资料提示，粘质沙雷氏菌制剂具 有巨隧细胞及T淋己系统刺激活性，可诱导巨隧细胞吞隧功能增强和分泌肿瘤坏死因子 (TNF)、干扰素（IFN)、白介素I(IL-I)及IL-2等免疫因子，可增强NK细胞杀伤活性，可抑制肿 瘤转移相关基因nm23-l和Tiam-I的表达。比如粘质沙雷氏菌DNA含有的乂 pG结构"，具有强 大的免疫调节作用，能活化NK细胞、巨隧细胞和树突状细胞等抗原提呈细胞，使之产生IFN 和IL-12等化1细胞因子，从而抑制化2细胞因子化-4、比-5的产生，并阻断I巧的合成，从而 有效抑制反应原诱导的高反应性及变态反应性改变，改善免疫功能的素乱。同时粘质沙雷 氏菌可W提高外周血及局部灌注周围组织的T细胞亚群的功能，CD4+和CD8+细胞增加，改善 机体免疫功能低下，激活免疫系统，纠正细胞免疫及体液免疫的异常，从而促进疾病的恢 复。
[0005] 总之，对于粘质沙雷氏菌，前人虽然已做了许多研究，也公开过多个专利资料，但 终因疗效不够突出至今没有发展成真正的临床药物，一直停留在实验室研究阶段。
【发明内容】
[0006] 针对上述现有技术，为了获得更加突出的抑瘤效果的沙雷氏菌，本发明对引自中 国菌种库的沙雷氏菌进行了紫外诱变，并采用抑瘤实验、观察抑瘤效果，筛选获得了一株对 A549实体瘤和S180腹水瘤疗效非常突出的粘质沙雷氏突变菌株，而且疗效是在不产生灵菌 红素的情况下产生的。经16S rDNA测序、比对，确定所筛选菌株为粘质沙雷氏菌。
[0007] 本发明是通过W下技术方案实现的：
[000引一株粘质沙雷氏菌，该菌株分类命名为沙雷氏菌Serratia SP.，已于2016年Ol月 11日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中屯、，保藏编号为CGMCC NO.11987。
[0009] 所述粘质沙雷氏菌的16S rDNA序列，经与Genbank中其它菌的16S rDNA序列相比 对，此菌株与Genbank中Serratia SP.CH-B17同源性为99.79% ;与Serratiasp.E化4相似率 99.78% ,Serratia marcescens strainTCCC11387相似率99.77% ,Serratia marcescens 8付日;[]141]1209相似率99.76%，56祥日1:13 1]1日1'。63。6]13 8化日;[]1沈1?1相似率99.437%，运些 菌株同属于粘质沙雷氏菌。
[0010] 所述粘质沙雷氏菌，经实验证明，对A549实体瘤和S180腹水瘤的抑制效果明显，疗 效非常突出，因此，可W W该粘质沙雷氏菌为原料制备用于抑制肿瘤的药物，比如:培养该 菌获得培养物，并添加或不添加其它药物、辅料等加工制备成菌剂。本发明为研究沙雷氏菌 的抑制肿瘤机制、用途、药物开发等提供了优良的菌种资源。
【附图说明】
[0011] 一株粘质沙雷氏菌SM-1，该菌株分类命名为沙雷氏菌Serratia SP.，已于2016年 Ol月11日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中屯、，保藏编号为CGMCC NO. 11987，保藏地址为:北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮编：100101。
[001 ^ 图1:正常对照组动物腹腔洗液涂片（200 X )。
[0013]图2:正常对照组动物腹腔洗液涂片(400 X )。
[0014] 图3:模型组动物腹水涂片(200 X )。
[0015] 图4:模型组动物腹水涂片(400 X )。
[0016] 图5:多西他赛对照组动物腹水涂片(200X )。
[0017] 图6:多西他赛对照组动物腹水涂片(400X )。
[001引图7: A群链球菌对照组动物腹水涂片(200 X )。
[0019] 图8:4群链球菌对照组动物腹水涂片（400乂）。
[0020] 图9: SMl组组动物腹水涂片(200 X )。
[0021] 图10: SMl组动物腹水涂片(400 X )。
[0022] 图11:模型对照组长出肿瘤的小鼠图。
[0023] 图12:模型组死亡的小鼠。
[0024] 图13:接种A549细胞各组小鼠的肿瘤照片，其中，A为模型对照组，B为多西他赛治 疗组，C为A群链球菌治疗组，D为SM3组，E为SMl，F为SM5组。
[00巧]图14:实验组脾脏组织增大。
[00%]图15:进化树示意图。
【具体实施方式】
[0027] 下面结合实施例对本发明作进一步的说明。
[0028] 下述实施例中所设及的仪器、试剂、材料等，若无特别说明，均为现有技术中已有 的常规仪器、试剂、材料等，可通过正规商业途径获得。下述实施例中所设及的实验方法，检 测方法等，若无特别说明，均为现有技术中已有的常规实验方法，检测方法等。
[0029] 实施例1菌种诱变
[0030] ( - )菌种诱变方法
[0031] 1.菌种扩增
[0032] 菌种源自中国普通微生物菌种保藏管理中屯、保藏的粘质沙雷氏菌，保藏号： CGMCC1.0589。无菌条件下，取原菌种10倍梯度稀释后分别涂布在LB斜面培养基上37°C培养 2地。选择菌落数目约为20个的平板，挑取较大、界限清晰、呈乳白色长势良好的单菌落作为 紫外诱变的出发菌株，取其菌体于生理盐水和玻璃珠的S角瓶中制成无菌菌悬液SOOmL，30 °C、250巧m水浴地，制备成IO 6CFlVmL的诱变菌悬液，备用。
[0033] 2.菌株诱变
[0034] 紫外灯预热25min，分别取菌悬液IOmL置于多个平板(D = 9cm)中，均匀放置紫外灯 下25cm处照射不同的时间（0，10，15，20，25，30，35，40，45，50，55，60s )，然后分别从每个平 板中取出ImL的菌悬液W生理盐水定容至IOmL,逐级稀释至1〇-1、1〇-2、1〇- 3、1〇-4、1〇-5、1〇-6 倍，取各个梯度的稀释液10化L在暗处涂布于平板固体培养基上，37°C培养2地;取出，挑取 长势良好的菌落，试管斜面固体培养基保存，进行高产菌株的筛选。同时，用未照射的菌悬 液做空白对照，计算紫外诱变致死率。
[0035] 致死率=紫外诱变菌悬液的菌落数/未诱变菌悬液的菌落数。
[0036] 3.菌株选择一一根据细菌生长状况选择
[0037] 3.1.平板初筛
[003引根据紫外诱变选取照射30s的诱变菌悬液生理盐水稀释至10-1、10-2、10- 3、10-4、10 4、1(T6倍，分别涂布于平板固体培养基，37°c培养24h。^菌落大小和生长状态为观测指标 选取单菌落35株，试管斜面传代3次后，稳定生长的共6株，分别命名为SMl~6。
[0039] 3.2.摇瓶复筛
[0040] ①菌种：SMl、SM2、SM3、SM4、SM5、SM6。
[0041 ]②方法步骤:将上述菌株与出发菌株SMO分别采用10 %的接种量置于装有LB液体 培养基的S角瓶(25mL/100mL)中、37°C培养2化，摇床