一种丁酸梭菌及其培养方法与应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及微生物领域中的一种丁酸梭菌及其培养方法与应用。
【背景技术】
[0002]丁酸梭菌在自然界中主要存在于奶酪、天然酸奶、人与动物粪便及土壤中。丁酸梭菌作为微生态制剂的研究是由日本千叶医科大学宫入近治博士首先发现并报告。1935年，俄罗斯微生物研究所Kingi miyairi博士从人的奠便和土壤中分离出丁酸梭菌，可调节人体肠道微生态平衡，具有极强的整肠作用。丁酸梭菌在人体肠道内可体现三大生物特性:第一、促进肠道有益菌群(双歧杆菌、乳酸杆菌)的增殖和发育，抑制肠道内有害菌和腐败菌的生长、繁殖，纠正肠道菌群紊乱，减少肠毒素的发生。第二、在肠道内能产生B族维生素、维生素K、淀粉酶、蛋白酶等物质、对人体具有保健作用。第三、丁酸梭菌的主要代谢产物丁酸是肠道上皮组织细胞的再生和修复主要营养物质。
[0003]白丁香，中药名。为文鸟科动物麻雀的粪便，干燥的雀粪，呈圆柱形，有时稍弯曲，长5-8 mm，直径1-2 mm。表面灰白色或灰棕色。质稍硬，易折断。断面棕色，呈粒状。气微腥臭，分布于我国几遍及全境平地。具有消积，明目之功效。常用于积聚，疝气，外用治目翳，痈疽疮疖，扁桃体炎;龙涎香，在西方又称灰琥珀，是一种外貌阴灰或黑色的固态腊状可燃物质，鲸消化系统的肠梗阻所产生。行气活血，散结止痛，利水通淋。用于咳喘气逆，气结症积，心腹疼痛，淋病;鸡矢白:鸡矢白即家鸡粪便上的白色部分。性味甘咸，凉，有利水，泄热，祛风，解毒等作用，可治鼓胀积聚，黄疸，风痹等;夜明砂，本品为少常用中药，原名天鼠屎，"神农本草经〃列为中品，〃日华本草〃称夜明砂。生药为蝙蝠类动物的干燥粪便;望月砂又称里!砂，为兔科动物野兔的干燥粪便，是一味中药，主要治疗眼睛疾病和痔漏等症;五灵脂是哺乳纲、鼯鼠科动物复齿鼯鼠(寒号鸟)、飞鼠或其它近缘动物的粪便，具有疏通血脉，散瘀止痛的功效;是妇科要药;黑冰片，为猪科动物野猪的干燥粪便，用于消化不良，希拉痞，粘症。
[0004]目前报道的能产丁酸的菌有:丁酸梭菌(Clostridiumbutyricum)、酪丁酸梭菌(Clostridium tyrobutyricum)、柔嫩梭菌(Clostridium Ieptum)、球形梭菌(Clostridiumcoccoides)、人罗斯拜瑞氏菌(Roseburia hominis)、霍氏真杆菌(Eubacterium hallii)、直肠真杆菌(Eubacterium rectale)、普氏栖奚杆菌(Faecalibacterium prausnitzii)和奚厌氧棒状菌(Anaerostipes caccae) 0
【发明内容】
[0005]本发明的一个目的是提供一种丁酸梭菌，该丁酸梭菌能够合成益生因子丁酸，生产B族维生素、维生素K和多种氨基酸，分泌淀粉酶、蛋白酶。
[000?]本发明所提供的梭菌，被鉴定为丁酸梭菌(Clostridium butyricum)，来源于奠便中药(如白丁香、望月砂、龙涎香、鸡矢白、虫茶、五灵脂、夜明砂、黑冰片等)。
[0007]所述丁酸梭菌，其分类命名为丁酸梭菌(Clostridium butyricum) Q428，已保藏于中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC)，保藏编号为:CCTCC NO:M 2016089，保藏日期为:2016年3月7日，保藏地址为:中国.武汉.武汉大学。
[0008]本发明所提供的丁酸梭菌(Clostridium butyricum)Q428具有以下特征:
I)菌落特征:菌落直径为(0.6?1.4) X (2.3?7.3) μπι，菌落呈圆形，表面光滑，边缘整齐，凸起，白色或乳白色。
[0009]2)细胞形态特征:细胞为杆状，顶端圆钝;革兰氏染色阳性;细胞直径1.3-3.2 _。
[0010]3)生理生化特征:厌氧生长；不水解明胶，不消化血清蛋白，能够发酵葡萄糖、蔗糖、果糖和乳糖等糖类生产丁酸，一个显著的特征是产生淀粉酶，水解淀粉但不水解纤维素。水解淀粉和糖类的最终代谢产物为丁酸、乙酸和乳酸，还发现有少量的丙酸和甲酸，硝酸盐还原试验均为阴性。
[0011]4)丁酸梭菌(Clostridium butyricum)Q428的 16S rRNA基因序列长度为1,516bp，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
[0012]本发明的另一个目的是提供一种培养丁酸梭菌(Clostridium butyricum)Q428的方法。
[0013]本发明所提供的培养丁酸梭菌(Clostridiumbutyricum)Q428的方法，是将丁酸梭菌(Clostridium butyricum)Q428接种于RCM培养基，在36 °C ,pH 6.8的条件下培养。
[0014]在1,000 mL上述RCM培养基中含有:胰蛋白胨，10 g;牛肉膏，10 g;葡萄糖，5 g;氯化钠，5 g;酵母膏，3 g;乙酸钠，3 g;可溶性淀粉，I g;L-半胱氨酸盐酸盐，0.5 g;余量为水。
[0015]上述RCM培养基还包括氧化还原指示剂，具体可为刃天青，其含量为0.5mg/L。
[0016]本发明培养方法中，所需的厌氧环境是通过85%N2^ 10% H2和5%C02的混合气得到的，一般注入达到I个大气压的量。
[0017]本发明所提供的丁酸梭菌(Clostridiumbutyricum)Q428易培养，培养效率高，可达4.75X19 CFU/mL0
[0018]本发明的丁酸梭菌(Clostridium butyricum)Q428是从奠便中药(如白丁香、望月砂、龙涎香、鸡矢白、虫茶、五灵脂、夜明砂、黑冰片等)中分离得到的，是一种能够利用葡萄糖、木糖、乳糖、蔗糖、阿拉伯糖等多种底物进行产酸发酵，主要发酵产物为丁酸，是一种适合于木质纤维素同步糖化发酵生产丁酸的菌种。2014年12月16日，欧盟委员会发布关于批准丁酸梭菌(CBM 588)作为新食品原料投放市场的决定，并规定了其使用规格和指标。当其作为新食品原料用于食品补充剂时，最大剂量为1.35X 18 CFU/天，还需满足2002/46/EC的相关要求。由于它具有耐热耐酸及对常用抗生素有抗性等特点，在临床上广泛用于预防由大肠杆菌等病原菌。因此本发明中的丁酸梭菌(Clostridium butyricum)Q428在新资源食品产业和益生因子丁酸的生产中有广阔的应用前景。
[0019]本发明所述的生物材料，其分类命名为丁酸梭菌(Clostridiumbutyricum)Q428，已保藏于中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC)，保藏编号为:CCTCC Ν0:Μ 2016089，保藏日期为:2016年3月7日，保藏地址为:中国.武汉.武汉大学。
【具体实施方式】
[0020]下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明均为常规方法。
[0021]实验中所使用的RCM液体培养基的基本组成为(/升):
胰蛋白胨，10 g;牛肉膏，10 g;葡萄糖，5 g;氯化钠，5 g;酵母膏，3 g;乙酸钠，3 g;可溶性淀粉，I g;L-半胱氨酸盐酸盐，0.5 g;刃天青，0.5 mg;蒸馈水定容至1000 mL。
[0022]实验中所使用的RCM固体培养基是向上述RCM液体培养基中加入15g琼脂，使其终浓度为1.5%。
[0023]实施例1、菌株丁酸梭菌(Clostridium butyricum)Q428的分离制备
取粪便中药(如白丁香、望月砂、龙涎香、鸡矢白、虫茶、五灵脂、夜明砂、黑冰片等)水解液，将其接种于以木糖为底物的RCM液体培养基中传代培养，得到富集物;用富集物作为接种源，将其接种于以葡萄糖为底物的RCM固体培养基，用Hungate滚管技术分离得到。
[0024]将其保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为:CCTCC Ν0:Μ 2016089。
[0025]实施例2、菌种鉴定一、形态及生理生化特征
将菌株丁酸梭菌(Clostridium butyricum)Q428接种于以葡萄糖为底物的RCM固体培养基(含质量百分含量为1.5%的琼脂)，在pH为6.8，温度为36 °C的条件下厌氧培养48 h。
[0026]观察菌落及细胞的形态特征，并进行如下生理生化实验:I革兰氏染色试验;2血清蛋白试验;3液化明胶试验;4还原硝酸盐试验;5底物利用试验。
[0027]观察结果及实验结果如下:
I)菌落特征:菌落直径为(0.6?1.4) X (2.3?7.3) μπι，菌落呈圆形，表面光滑，边缘整齐，凸起，白色或乳白色。
[0028]2)细胞形态特征:细胞为杆状，顶端圆钝;革兰氏染色阳性;细胞直径1.3-3.2 mm。
[0029]3)生理生化特征:厌氧生长;革兰氏染色呈阳性;不水解明胶;不消化血清蛋白；能够发酵葡萄糖、蔗糖、果糖和乳糖等糖类产酸，一个显著的特征是产生淀粉酶，水解淀粉但不水解纤维素。水解淀粉和糖类的最终代谢产物为丁酸、乙酸和乳酸，还发现有少量的丙酸和甲酸;硝酸盐还原试验均为阴性。
[0030]二、菌株丁酸梭菌(Clostridium butyricum)Q428的 16S rRNA基因的PCR扩增和序列测定
I)提取DNA (参照TAKARA提基因组试剂盒)
将丁酸梭菌(Clostridium butyricum)Q428接种于RCM液体培养基培养;取生长至对数晚期的发酵液，12，000转/分钟离心5分钟，去除上清液;加入500 yL的Buffer BS重悬细胞，加入50 yL的LySOZyme(20 mg/mL)，充分吸打混匀，于37 °(:水浴温育I小时(每隔20分钟颠倒混勾一次)；12，000 rpm离心5分钟，弃上清；加入180 yL的Buffer GL、20 yL的Proteinase K(20 mg/mL)和10 yL的RNase AC 10 mg/mL)，充分吸打混勾，于56 °(^水浴温育10分钟；加入200 yL的Buffer GB和200 yL的100%乙醇，充分混匀；将Spin Column安装在Collect1n Tube上，溶液移至Spin Column中，12,000 rpm离心2分钟，弃滤液;将500 yL的Buffer WA加入至Spin Column中，12,000 rpm离心I分钟，弃滤液；将700 yL的Buffer WB加入至Spin Column中，12，000 rpm离心I分钟，弃滤液，重复一次；将Spin Column安置在Collect1n Tube上，12,000 rpm离心2分钟;将Spin Column安置在新的1.5 mL离心管上，在Spin Column膜的中央处加入50?200 yL的65°C灭菌蒸馈水，室温静置5分钟；12,000 rpm离心2分钟洗脱DNA 2)16S rRNA基因的PCR扩增及测序
用于PCR扩增的正向引物为5’-TTTTATTGAGAGTTTGATCCTGGCT-3’，反向引物为5’-NGAAAGGAGGTGATCNNNNNNCAGG-3’C3PCR反应体系(25 yL)为:Mix 25 yL；ddH20 8.5 yL;正反向引物各I yL;DNA模板2 yLoPCR反应条件为:95 °C 5 min，95 °C I min，60 °C 30 s，72°C 2 min，30个循环;72 °C 7 min，4 °C保存。
[0031]PCR产物的测序送至金唯智公司完成
测序结果表明，菌株丁酸梭菌(Clost