表达红色荧光蛋白的重组沙门氏菌及其构建方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及基因工程领域，具体地说，设及一种表达红色巧光蛋白的重组沙口氏 菌及其构建方法。
【背景技术】
[0002] 沙口氏菌属（Salmonella)是沙口氏菌病的病原体。属于肠杆菌科，革兰氏阴性肠 道杆菌。已发现的近千种沙口氏菌菌株，按其抗原成分，可分为甲、乙、丙、下、戊等基本菌 组。其中与人体疾病有关的主要有甲组的副伤寒甲杆菌，乙组的副伤寒乙杆菌和鼠伤寒杆 菌，丙组的副伤寒丙杆菌和猪霍乱杆菌，下组的伤寒杆菌和肠炎杆菌等。除伤寒杆菌、副伤 寒甲杆菌和副伤寒乙杆菌引起人类的疾病外，大多数仅能目引起家畜、鼠类和禽类等动物 的疾病，但有时也可污染人类的食物而引起食物中毒。
[0003] 沙口氏菌是一种常见的食源性致病菌。沙口氏菌最适繁殖溫度为37°C，在20°C W 上即能大量繁殖，因此，低溫储存食品是一项重要的预防措施。
[0004] 构建能够表达巧光蛋白的重组沙口氏菌，可为临床分离的沙口氏菌的深入研究提 供有效手段。国内已有表达绿色巧光蛋白的减毒鼠伤寒沙口氏菌的构建方法(王芳，江苏农 业研究，2001,22(3):55-58.),该方法需将重组质粒转化入沙口氏菌中间宿主后进行阳性 克隆筛选，再从阳性菌体中提取出质粒，最终转化入沙口氏菌终末宿主。该方法需要中间宿 主的参与，过于繁琐，且绿色巧光标记较为常见，如果试验中需要与其他目的蛋白进行共定 位，则二抗就不能再使用常见的FITC进行巧光标记。因此，有必要开发一种新型的能够表达 巧光蛋白的重组沙口氏菌。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是提供一种表达红色巧光蛋白的重组沙口氏菌及其构建方法。
[0006] 为了实现本发明目的，本发明提供的表达红色巧光蛋白的重组沙口氏菌，所述重 组沙口氏菌是用质粒pFPV-m化er巧转化沙口氏菌获得的阳性克隆。
[0007] 本发明还提供所述重组沙口氏菌的构建方法，将质粒pFPV-m化erry通过电击转化 的方式进入沙口氏菌体内，并筛选阳性克隆。
[0008] 本发明所述的沙口氏菌包括但不限于德尔卑沙口氏菌、婴儿沙口氏菌。
[0009] 前述的方法，优选用抗生素---氨节青霉素筛选阳性克隆。
[0010] 前述的方法具体包括W下步骤：
[0011 ] 步骤1:质粒pFPV-mCherry的提取；
[0012] 步骤2:沙口氏菌感受态细胞的制备；
[0013] 步骤3:电击转化；
[0014] 步骤4:阳性克隆的筛选；
[0015] 步骤5:重组菌的形态学的鉴定、生长曲线测定、遗传稳定性分析及毒力因子检测。 [0016]步骤1具体为：用质粒提取试剂盒提取质粒pFPV-m化erry，提取后测定质粒浓度， 使质粒浓度达到5pg-化ng/化。例如，使用OMEGA公司的E.Z.N.A瓜Plasmid Mini Kit II试 剂盒提取质粒，提取后使用NanoDrop⑥ND-2000C测定浓度，调整合适浓度，使转化时用量 为1 -化L，质粒DNA含量为10pg-25ng。
[0017] 步骤2具体为：
[0018] (1)使用LB培养液于37 °C 20化pm的摇床振荡培养沙口氏菌，测量培养液ODs日日值，待 ODsoq值在0.35-0.45之间时，迅速将菌液冰浴15-30min，不时缓慢摇匀W保证菌液充分冷 却；
[0019] (2)4°CW4000g离屯、lOmin，回收细胞;然后用冰冷的纯水重悬细胞后再次离屯、洗 涂，将其中的电解质杂质洗掉，并逐步用10%甘油重悬、洗涂;最后Wlml冰冷的10%甘油重 悬沉淀；
[0020] (3)稀释上述悬液后测量ODsoo值，用冰冷的10%甘油将其稀释至浓度为2 X l〇w~3 X l〇w个细胞/ml (ODsgg值1.0，约2.5 X 10"个细胞/ml)，准备电击转化。
[0021] 或者，冻存在-80°C，将感受态细胞悬液按50化/份分装到冷却的无菌0.5ml微量离 屯、管中，封紧管口，没入液氮中快速冰冻。胆存于-80°C备用。需要用冻存的感受态细胞做电 击转化时，从-80°C冰箱中取出适当的份数，待其融化后按照电击转化的操作进行。
[0022] 步骤3具体为：
[0023] (1)用移液器吸取50化新鲜制备或冻融的沙口氏菌感受态细胞于0.5ml冰冷的微 量无菌离屯、管中，与电转化仪样品池一起放在冰上冷却；
[0024] (2) Wl-化L的体积向每个离屯、管中加入10pg-25ng的待转化质粒DNA，置于冰上 3〇-60s;
[0025] (3)调节电转仪，使电脉冲为25iiF，电压25kV，电阻200 Q ;将感受态细胞与质粒DNA 的混液加至冰冷的电击杯内，将电击杯放进电转仪中，按上述设定的参数，启动对细胞的电 脉冲;仪器应显示出4-5ms具有12.5kV/cm的电场强度；
[00%] (4)脉冲结束后，迅速取出样品池，室溫下加入1ml LB肉汤培养基，37°C16化pm振 荡培养化W复苏细菌；
[0027] (5)取不同体积的电击转化后的细菌，铺于含有氨节青霉素的LB琼脂培养基;室溫 下待培养基中的液体被完全吸收，倒置琼脂培养基，于37°C培养箱培养12-1化，转化克隆即 重组菌应在12-1化出现。
[0028] 步骤4具体为：
[0029] (1)配制LB肉汤培养基或LB琼脂培养基，高压灭菌后待其溫度降至50°C-55°C时 (琼脂培养基溫度不能太低，否则会凝固，故可使用恒溫水浴锅W保证溫度），加入适量氨节 青霉素使其终浓度为10化g/ni;
[0030] (2)使用含有氨节青霉素的LB液体或固体培养基培养的细菌，则为具有氨节青霉 素抗性的阳性克隆；
[0031] (3)进一步使用选择性培养基化D/SS验证筛选，在化D/SS培养基中加入氨节青霉 素培养的细菌为阳性克隆;或者将培养后的菌涂于载玻片上，在巧光倒置显微镜下观察，若 能看到相应的巧光，则为阳性克隆。
[0032] 步骤5中所述形态学的鉴定具体为：
[0033] (1)将冻存的转化成功的重组菌在含有氨节青霉素的LB肉汤培养基中活化、传代 3-4代。同时在普通LB培养基中传代培养受体沙口氏菌(即原始沙口氏菌）。
[0034] (2)将传代后的菌W合适的浓度均匀涂布于含有氨节青霉素的LB琼脂培养基上。 同样在普通LB琼脂培养基上涂布受体沙口氏菌，37°C恒溫培养箱培养12-2地，比较菌的形 态特征并拍照。
[0035] 步骤5中所述生长曲线测定具体为：
[0036] (1)从-80°C冰箱中取出冻存的沙口氏菌按普通的方法活化，传代3-4代，重组菌培 养的整个过程均应添加氨节青霉素，下同。
[0037] (2)使用预置有300mL LB肉汤培养基的500血容量的S角瓶，分别加入15mL上一步 中培养的菌液，37 °C恒溫振荡培养，200巧m。
[0038] (3)每隔化取出菌液，用分光光度计测定ODsoo值，监测生长曲线趋势，测定到对数 末期即可。
[0039] (4)统计整理数据结果，并作图。
[0040] 步骤5中所述遗传稳定性分析具体为：
[0041] (1)将重组菌株涂布于加有氨节青霉素的LB琼脂平板，在37°C恒溫培养16h;
[0042] (2)挑取单菌落接种于含有氨节青霉素的7mL LB肉汤培养基中，去除不含质粒的 阴性沙口氏菌，过夜培养(8-lOh)使细菌达到生长对数中后期；
[0043] (3)然后取70化上述菌液接种于不含抗生素的7ml LB肉汤培养基中，37°C培养 12h，然后取出70iiL同样接种于不含抗生素的7ml LB肉汤培养基中；
[0044] (4)重复(3)的操作8次(根据菌落计数方法，每培养1