一种裸鼹鼠少突胶质前体细胞培养方法
【技术领域】
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[0001 ]本发明涉及细胞生物学技术领域，具体涉及一种细胞的分离纯化及培养方法，特别涉及一种裸鼹鼠少突胶质前体细胞的分离纯化和培养方法。
【背景技术】
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[0002]少突胶质细胞(Oligodendrocyte)是中枢神经系统的成髓鞘细胞，其包绕有髓神经元轴突形成的髓鞘结构对神经元有营养、支持和保护作用，并且髓鞘的存在是神经元轴突动作电位高效传导的结构基础，能够保证神经元之间信息传递的速率。少突胶质细胞是由少突胶质前体细胞分化而来，在病理情况下，少突胶质前体细胞可以受到微环境的刺激而再次启动分化。在中风、脑白质营养不良以及新生儿缺血缺氧性脑病等多种与脑缺血缺氧相关的疾病中一般会伴随有髓鞘的损伤(Billiards SS1Haynes RL1Folkerth RD,Borenstein NSjTrachtenberg FL,Rowi tch DH,Ligon KL,Volpe JJ, KinneyHC.2008.Myelin abnormalities without oligodendrocyte loss in periventricularleukomalacia.Brain Pathol 18:153-163.)0
[0003]裸鼹鼠是一种变温哺乳动物，在氧气浓度仅有6%左右的不通风洞穴中能够保持脑结构和功能的完整无损并进行正常的生命活动，尤其是耗氧量较高的少突胶质细胞。因此，研究裸鼹鼠少突胶质细胞特殊的低氧耐受能力对于脑缺血缺氧性疾病中少突胶质细胞损伤的治疗具有重要的指导意义。由于在体微环境非常复杂，无法在体直接观察少突胶质细胞在低氧环境中的功能改变情况及其适应机制，并且在体的结果可能容易受到微环境中其他细胞组分和结构的影响。因此需要建立离体的裸鼹鼠少突胶质细胞模型以弥补在体观察的缺陷。
[0004]而少突胶质细胞是由少突胶质前体细胞分化而来，虽然前者增殖能力较差，但是少突胶质前体细胞具有较强的分裂增殖能力，易于体外培养，并通过诱导其分化的方法得到少突胶质细胞。目前，研究人员已经摸索出诱导小鼠神经干细胞球分化为少突胶质前体细胞并进一步使其分化为少突胶质细胞，以及大鼠少突胶质前体细胞的培养方法(WenjingYang，Lin Xiao,Cui Li,Xiuyun Liu,Mingdong Liu，Qi Shao,Dan Wang,Aijun Huang andCheng He.TIP30 inhibits oligodendrocyte precursor cell differentiat1n viacytoplasmic sequestrat1n of Oligl.Glia.2015 ;63(4): 684-98.)。另外，中国专利CN200910251053.X，申请公布号为CN101735983A，公开了一种大鼠的少突胶质前体细胞的分离纯化方法，包括以下步骤:①获取混合细胞，混合细胞培养基由DMEM/F12培养基和体积分数为10 %的胎牛血清组成;②培养混合细胞:混合神经细胞培养基由DMEM/F12培养基、体积分数为I %的N2添加剂和体积分数为15?20%的B104条件培养基组成;③消化分离少突胶质前体细胞;④纯化少突胶质前体细胞:少突胶质前体细胞纯化培养基由无糖DMEM培养基、浓度为5?lOmmol/L的乳酸、体积分数为1%的N2添加剂和体积分数为15?20%的B104条件培养基组成。
[0005]但是现有技术中无论小鼠还是大鼠的少突胶质前体细胞分离纯化和培养方法均不适用于裸鼹鼠，目前国内外文献尚无有关裸鼹鼠少突胶质前体细胞分离纯化和培养方法的相关报道。
【发明内容】
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[0006]本发明的目的在于提供一种裸鼹鼠少突胶质前体细胞的分离纯化和培养方法，以方便、高效的获得纯度高、状态好的裸鼹鼠少突胶质前体细胞，为体外建立裸鼹鼠少突胶质前体细胞提供技术支持，同时为体外研究裸鼹鼠少突胶质前体细胞的分化、迀移以及低氧耐受能力、以及裸鼹鼠少突胶质细胞低氧耐受机制的阐述和相应治疗药物或靶分子的筛选提供强大的保障。
[0007]我们试用了目前小鼠、大鼠的少突胶质前体细胞分离纯化和培养方法，结果发现均无法培养获得纯度高、状态好的裸鼹鼠少突胶质前体细胞，而且裸鼹鼠少突胶质前体细胞增殖的数量也较少。
[0008]关于裸鼹鼠少突胶质前体细胞的培养尚没有建立出可行的实验方法，我们分析其原因，主要是:I)裸鼹鼠是一种变温动物，其体细胞离体培养的温度有待摸索，并且其不恒定的机体代谢速率导致其体细胞体外培养基区别于普通的大鼠或小鼠；2)裸鼹鼠生存在较为阴暗潮湿的环境中，其体细胞的培养对湿度有较高的要求;3)裸鼹鼠已经适应了外界低氧的环境，所以其体细胞离体培养环境中的氧气浓度区别于常氧环境中生活的动物，并且需要摸索。
[0009]因此，裸鼹鼠少突胶质前体细胞的培养中最重要的摸索到合适的温度、湿度和氧气浓度，以及摸索到适合的培养基。
[0010]为达到此目的，本发明的裸鼹鼠少突胶质前体细胞的分离纯化方法包括以下步骤:
[0011 ] A、收集裸鼹鼠大脑皮层混合胶质细胞:
[0012]分离出生1-7天裸鼹鼠大脑皮层组织，将组织剪碎，加入消化液混匀之后，将其放入三气培养箱中消化；用混合神经细胞培养基终止消化，离心去除上清之后，在混合神经细胞培养基中将细胞沉淀重悬并吹打成单细胞悬液;将单细胞悬液种于包被有左旋多聚赖氨酸的培养瓶中；
[0013]所述的组织消化液，可以为常规的蛋白水解酶类消化液，例如胰蛋白酶、木瓜蛋白酶等，辅以DNA酶以解除DNA片段粘连所致的细胞聚集。
[0014]优选的消化液:质量浓度为0.125%的胰酶和/或终浓度为0.2mg/ml的DNA酶。
[0015]所述的混合神经细胞培养基，可以为常规的含血清混合神经细胞培养液，例如低糖DMEM等。优选的混合神经细胞培养基为含有15 %体积百分比胎牛血清的低糖DMEM。
[0016]B、裸鼹鼠大脑皮层混合胶质细胞的培养:
[0017]将步骤A得到的混合胶质细胞，用混合神经细胞培养基中培养于三气培养箱中25-30天；自混合胶质细胞接种之后，每7天采取半量换液的方法更换胶质细胞混合培养基;
[0018]所述的混合神经细胞培养基，可以为常规的混合神经细胞培养液，例如含体积分数15 %胎牛血清的低糖DMEM等。
[0019]C、裸鼹鼠少突胶质前体细胞的分离及纯化培养:
[0020]将步骤B培养的混合神经细胞于恒温震荡摇床培养，恒温35± 2°C，将震荡培养的细胞悬液置于未包被有左旋多聚赖氨酸的培养皿中使细胞贴壁，使极易贴壁及贴壁能力强的其他胶质细胞贴于平皿底部，而少突胶质前体细胞由于仅在有左旋多聚赖氨酸包被的平皿商贴壁能力较强而悬浮在液体中，因此小心吸取上清，并将上清中的细胞种于包被有左旋多聚赖氨酸的培养皿中；待其贴壁后，用添加促分裂增殖因子的少突胶质前体细胞增殖培养基进行纯化培养；
[0021]所述的增殖培养基为NeUr0basal/B27和促分裂增殖因子等，优选的增殖培养基为Neurobasal和B27以体积比为50:1的组合(添加体积百分数为2%B27的Neurobasal) ο
[0022]添加促分裂增殖因子指的是添加B104条件上清。
[0023]所述的三气培养箱的参数设置为:温度控制在35±2°C，氧浓度为5%，二氧化碳浓度为5±1%，湿度为96±2%。
[0024]进一步，步骤A中，取出生1-7天裸鼹鼠大脑，剥除脑膜后分离皮层组织，用显微剪将组织剪碎至Imm3，加入消化液混匀之后，将其放入三气培养箱中消化;消化条件为:胰酶浓度为0.125%，DNA酶浓度为0.2mg/ml，时间为30分钟;然后用混合神经细胞培养基终止消化，离心去除上清之后，在混合神经细胞培养基中将细胞沉淀重悬并吹打成单细胞悬液;随后将单细胞悬液种于包被有左旋多聚赖氨酸的T25培养瓶中。
[0025]进一步，步骤A中，所述左旋多聚赖氨酸浓度为0.01mg/ml。
[0026]进一步，步骤A中，所述离心参数设置为室温下，SOOrpm，5分钟。
[0027]进一步，步骤B中，用混合神经细胞培养基中培养于三气培养箱中28天。
[0028]进一步，步骤C中，所述震荡培养时间为20小时。
[0029]进一步，步骤C中，所述恒温震荡摇床转速为200rpm。
[0030]进一步，步骤C中，恒温震荡培养过程中保持培养瓶口旋紧以减少瓶内外空气交换。
[0031]进一步，步骤C中，所述细胞贴壁时间为I小时。
[0032]进一步，步骤C中，所述B104条件上清的收集是利用神经母细胞瘤B104细胞培养于二气培养箱中，利用增殖培养基进行培养，待细胞生长至80 %融合度时，换为Neurobasal/B27培养基培养48小时，随后收集上清并用0.22μπι滤器过滤后置于-70°C保存备用。
[0033]进一步，所述二气培养箱参数设置为:37°C，21 %氧气浓度，5 % 二氧化碳浓度，以及96%湿度。
[0034]进一步，所述少突胶质前体细胞增殖培养基为含有体积分数为30%B104条件上清的低糖DMEM。
[0035]本发明的有益效果在于:A、综合使用多种培养基从裸鼹鼠新生鼠大脑皮层分离并纯化培养少突胶质前体细胞，摸索出了适于变温的啮齿类哺乳动物裸鼹鼠少突胶质前体细胞的合理培养方法。我们发现5%氧浓度条件下，细胞状态能够得到较好的保持，并能够保持增长;B、操作方法简单，具有较高的可重复性。利用摇床将所需的少突胶质前体细胞按一定的转速摇下，再进行第二次差速贴壁纯化，不仅能够得到纯度为98%以上的少突胶质前体细胞，而且能够最大程度的保持细胞活力和功能;C、通过使用少突胶质前体细胞增殖培养基，有效的保证了少突胶质前体细胞的增殖并保证纯度能够达到98%以上(针对少突胶质前体细胞特异性标记物NG2进行的免疫细胞化学染色结果)；④增殖培养基中无需额外添加生长因子，只需要利用B104细胞系的上清即可达到促进少突胶质前体细胞增殖的效果。
[0036]综上所述，本发明方法能够简便、高效、经济的获得大量功能活性正常的裸鼹鼠少突胶质前体细胞，低氧条件下的培养能够保证这种细胞在离体环境中依然能够保持在体状态下的生物学特性，从而便于直接在纯净的体外细胞培养模型中进一步研究裸鼹鼠少突胶质前体细胞的特殊生理功能，从而为探索其中的生物学机制并应用于临床相关领域提供重要的理论依据。
【附图说明】
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[0037]图1为体外培养的混合神经细胞，其中A为40倍镜下混合神经细胞，B为200倍镜下混合神经细胞。
[0038]图2为体外培养的少突胶质前体细胞(100倍光镜)。
[0039]图3为体外纯化培养的少突胶质前体细胞免疫细胞化学染色鉴定，其中A为NG2，B为Hoechst，C为NG2/Hoechst ο
【具体实施方