动物模型及治疗分子的制作方法
【专利说明】动物模型及治疗分子
[0001] 本申请是2011年1月7日提交的题为"动物模型及治疗分子"的中国专利申请 201180039668.1的分案申请。
[0002] 发明背景
[0003] 本发明设及非人动物和细胞，它们被工程化而含有外源DNA，如人免疫球蛋白基因 DNA，本发明还设及它们在医学和疾病研究中的应用，产生非人动物和细胞的方法，W及由 运种动物产生的抗体和抗体链及其衍生物。
[0004] 为了解决人源化抗体的问题，许多公司着手产生具有人免疫系统的小鼠。使用的 策略是敲除ES细胞中的重链和轻链基因座并且用设计为表达人重链和轻链基因的转基因 互补运些遗传损害。尽管可W产生完全人抗体，但是运些模型具有一些主要限制：
[0005] (i)重链和轻链基因座的大小（均几 Mb)使得在运些模型中不能导入完整基因座。 结果获得的转基因品系具有非常有限的V区组成部分，丧失了大多数恒定区并且重要的远 端增强子区未包含在转基因中。
[0006] (ii)产生大插入物转基因品系的极低效率W及将运些杂交进重链和轻链敲除品 系W及使它们再次纯合的复杂性和所需要的时间，限制了可W被分析而优化表达的转基因 品系数量。
[0007] (iii)个体抗体亲和性很少会达到从完整动物(非转基因）中可获得的程度。
[000引 W02007117410掲示了表达嵌合抗体的嵌合构建体。
[0009] W02010039900掲示了具有编码嵌合抗体的基因组的敲入化nock in)细胞和哺乳 动物。
[0010] 本发明提供了在非人类哺乳动物中产生包含人类Ig可变区的抗体的方法，本发明 进一步提供了产生运种抗体的非人动物模型。
[00川发明概述
[0012] -方面，本发明设及非人类哺乳动物，其基因组包含：
[0013] (a)位于宿主非人类哺乳动物恒定区上游的多个人类IgH V区、一或多个人类D区 及一或多个人类J区；
[0014] (b)任选地，位于宿主非人类哺乳动物K恒定区上游的一或多个人类Ig轻链KV区和 一或多个人类Ig轻链Kj区和/或位于宿主非人类哺乳动物M直定区上游的一或多个人类Ig 轻链AV区和一或多个人类Ig轻链AJ区；
[0015] 其中所述非人类哺乳动物能产生具有非人类哺乳动物恒定区和人类可变区的嵌 合抗体或者嵌合抗体轻链或重链的所有组成成分(repertoire)。
[0016] 一方面，本发明设及非人类哺乳动物，其基因组包含：
[0017] (a)位于宿主非人类哺乳动物K恒定区上游的多个人类Ig轻链KV区和一或多个人 类Ig轻链Kj区和/或位于宿主非人类哺乳动物M直定区上游的多个人类Ig轻链W区和一或 多个人类Ig轻链W区;及
[0018] (b)任选地，位于宿主非人类哺乳动物恒定区上游的一或多个人类IgH V区、一或 多个人类D区和一或多个人类J区；
[0019] 其中所述非人类哺乳动物能产生具有非人类哺乳动物恒定区和人类可变区的嵌 合抗体或者嵌合轻链或重链的所有组成成分。
[0020] -方面，本发明设及非人类哺乳动物细胞，其基因组包含：
[0021] (a)位于宿主非人类哺乳动物恒定区上游的多个人类IgH V区、一或多个人类D区 和一或多个人类J区，及
[0022] (b)任选地，位于宿主非人类哺乳动物K恒定区上游的一或多个人类Ig轻链KV区和 一或多个人类Ig轻链Kj区和/或位于宿主非人类哺乳动物M直定区上游的一或多个人类Ig 轻链AV区和一或多个人类Ig轻链AJ区。
[0023] -方面，本发明设及非人类哺乳动物细胞，其基因组包含：
[0024] (a)位于宿主非人类哺乳动物K恒定区上游的多个人类Ig轻链KV区和一或多个人 类Ig轻链Kj区和/或位于宿主非人类哺乳动物M直定区上游的多个人类Ig轻链W区和一或 多个人类Ig轻链W区;及
[0025] (b)任选地，位于宿主非人类哺乳动物恒定区上游的一或多个人类IgH V区、一或 多个人类D区和一或多个人类J区。
[0026] 另一方面，本发明设及产生非人类细胞或哺乳动物的方法，包括在非人类哺乳动 物细胞基因组例如ES细胞基因组中插入：
[0027] (a)多个人类IgH V区、一或多个人类D区和一或多个人类J区在宿主非人类哺乳动 物恒定区上游;及
[00%] (b)任选地，一或多个人类Ig轻链KV区和一或多个人类Ig轻链Kj区在宿主非人类 哺乳动物K恒定区上游和/或一或多个人类Ig轻链AV区和一或多个人类Ig轻链AJ区在宿主 非人类哺乳动物A恒定区上游；
[0029] 所述插入是使得所述非人类细胞或哺乳动物能产生具有非人类哺乳动物恒定区 和人类可变区的嵌合抗体的所有组成成分，其中步骤(a)和(b)可W任意顺序进行并且(a) 和(b)步骤的每一步可W逐步或单步进行。
[0030] 插入可W通过同源重组实现。
[0031] 另一方面，本发明设及产生特异于希望抗原的抗体或抗体链的方法，所述方法包 括用希望抗原免疫本文掲示的转基因非人类哺乳动物及回收所述抗体或抗体链。
[0032] 另一方面，本发明设及产生完全人源化抗体的方法，包括用希望抗原免疫本文掲 示的转基因非人类哺乳动物，回收所述抗体或产生所述抗体的细胞，然后例如通过蛋白质 或DNA工程用人类恒定区置换非人类哺乳动物恒定区。
[0033] 另一方面，本发明设及根据本发明产生的人源化抗体和抗体链，所述抗体和抗体 链均是嵌合的（例如小鼠-人类)及完全人源化形式，W及所述抗体和抗体链的片段和衍生 物，W及设及所述抗体、抗体链和片段在医学包括诊断中的应用。
[0034] 另一方面，本发明设及本文掲示的非人类哺乳动物作为模型检测药物和疫苗的应 用。
[0035] 附图简述
[0036] 图1 -8示出在小鼠Ig基因座中插入一系列人类BAC的重复过程。
[0037] 图9-18更详细示出针对和K基因座的图1-8的过程。
[0038] 图19和20示出在嵌合小鼠中的抗体产生原理。
[0039] 图21示出在小鼠染色体中人类DNA的可能插入位点。
[0040] 图22-26示出在小鼠Ig基因座中插入一系列人类BAC的另一重复过程。
[0041] 图27-29示出宿主VDJ区倒位的机制。
[0042] 图30示出使用RMCE方法插入质粒的原理证据。
[0043] 图31示出在着陆区（Landing化d)中相继的RMCE-整合。
[0044] 图32示出证实成功插入着陆区中。
[0045] 图33示出3'末端消除化nd化ring)的PCR证实。
[0046] 图34示出BAC#1插入和PCR诊断。
[0047] 图35示出JH和JK使用。
[004引图36示出DH使用。
[0049] 图37示出在来自嵌合小鼠的人类VDJ化转录物中CDR-册长度分布。
[0050] 图38示出在IGH-VDI或IGK-VJ连接中缺失和插入核巧酸数的分布。
[0051] 图39示出每个VH内JH使用的分布。
[0化2] 图40示出每个VH内DH使用的分布。
[0053] 图41示出在VJ连接点核巧酸获得或丧失产生IGK变体。
[0054] 图42示出J区内的超变产生IGK变体。
[0化5]图43示出连接多样性产生功能性CDS。
[0化6] SEQ ID No: 1是大鼠转换序列。
[0057] SEQ ID No:2是着陆区祀向载体的序列化版本）。
[005引SEQ ID No:3是着陆区祀向载体的序列(较短版本）。
[0化9] 沈Q ID No:4是小鼠品系129转换序列。
[0060] SEQ ID No:5是小鼠品系巧7转换序列。
[0061 ] 沈Q ID No:6是着陆区的5'同源臂。
[0062] 沈Q ID齡:7是寡核巧酸^2-5
[0063] 沈Q ID齡:8是寡核巧酸^4-4
[0064] 沈Q ID齡:9是寡核巧酸^1-3
[00化]沈Q ID齡：10是寡核巧酸^1-2
[0066] 沈Q ID齡：11是寡核巧酸^6-1
[0067] 沈Q ID No: 12是寡核巧酸化
[006引沈Q ID齡：13是寡核巧酸1(￥1-9
[0069] 沈Q ID齡：14是寡核巧酸1(￥1-8
[0070] 沈Q ID齡：15是寡核巧酸1(￥1-6
[0071] 沈Q ID齡：16是寡核巧酸1(￥1-5
[0072] 沈Q ID No: 17是寡核巧酸Ck。
[0073] -般描述
[0074] 除非特别指出，小鼠的所有核巧酸坐标是相应于小鼠巧7BL/6J品系的NCBI m37的 那些，例如April 2007 ENSEMBL Release 55.37h，如NCBI37化Iy 2007(NCBI build 37) (女日UCSC version mm9，见www. genome .ucsc.edu和http://genome .ucsc.edu/FAQ/ FAQreleases .himl)。除非特别指出，人核巧酸坐标是相应于GR畑37(如UCSC version hgl9,http://genome.ucsc.edu/FAQ/FAQreleases.html)、Feb 2009 ENSEMBL Release 55.37的那些或者是相应于NCBI36，Ensemblerelease54的那些。除非特别指出，大鼠核巧 酸是相应于RGSC 3.4 Dec 2004 ENSEMBL release55.34w或者Baylor College of Medicine HGSC v3.4 Nov 2004的那些（例如UCSC rn4，见www.genome.ucsc.edu和http:// genome.ucsc.edu/FAQ/FAQreleases.html)〇
[0075] 在本发明中，我们掲示了在非人类哺乳动物如小鼠中构建嵌合人类重链和轻链基 因座的方法。在小鼠中进行的研究只是为了例证，除非特别指出，在小鼠中进行的研究可W 包括所有非人类哺乳动物，优选小鼠作为非人类哺乳动物。
[0076] -方面，本发明设及非人类哺乳动物，其基因组包含：
[0077] (a)位于宿主非人类哺乳动物恒定区上游的多个人类IgH V区、一或多个人类D区 和一或多个人类J区，及
[0078] (b)任选地，位于宿主非人类哺乳动物K恒定区上游的一或多个人类Ig轻链KV区和 一或多个人类Ig轻链Kj区和/或位于宿主非人类哺乳动物M直定区上游的一或多个人类Ig 轻链AV区和一或多个人类Ig轻链AJ区；
[0079] 其中所述非人类哺乳动物能产生具有非人类哺乳动物恒定区和人类可变区的嵌 合抗体或抗体链的所有组成成分。
[0080] 另一方面，本发明设及非人类哺乳动物，其基因组包含：
[0081] (a)位于宿主非人类哺乳动物K恒定区上游的多个人类Ig轻链KV区和一或多个人 类Ig轻链Kj区和/或位于宿主非人类哺乳动物M直定区上游的多个人类Ig轻链W区和一或 多个人类Ig轻链W区，及
[0082] (b)任选地，位于宿主非人类哺乳动物恒定区上游的一或多个人类IgH V区、一或 多个人类D区和一或多个人类J区；
[0083] 其中所述非人类哺乳动物能产生具有非人类哺乳动物恒定区和人类可变区的嵌 合抗体的所有组成成分。
[0084] 任选地，所述非人类哺乳动物基因组被修饰为阻止完全宿主物种特异性抗体的表 达。
[00化]一方面，插入的人类DNA包含至少50%的人类重链可变(V)基因，如至少60%、至少 70%、至少80%、至少90%及在一个方面全部人类V基因。
[00化]一方面，插入的人类DNA包含至少50%的人类重链多样性(D)基因，如至少60%、至 少70%、至少80%、至少90%及在一个方面全部人类D基因。
[0087] -方面，插入的人类DNA包含至少50%的人类重链连接(J)基因，如至少60%、至少 70%、至少80%、至少90%及在一个方面全部人类J基因。
[0088] 一方面，插入的人类DNA包含至少50%的人类轻链可变(V)基因，如至少60%、至少 70%、至少80%、至少90%及在一个方面全部人类轻链V基因。
[0089] -方面，插入的人类DNA包含至少50%的人类轻链连接(J)基因，如至少60%、至少 70%、至少80%、至少90%及在一个方面全部人类轻链J基因。
[0090] 插入的人类基因可衍生自相同或不同个体，或者是合成的或者代表人类共有序 列。
[0091] -方面，尽管V、D和J区的数目在人类个体之间是可变的，但是据认为在重链上有 51个人类V基因、27个D基因和6个J基因，在K轻链上有40个人类V基因和5个J基因W及在入轻 链上有29 个人类 V基因和4个 J基因（Janeway and Travers,Immunobiology,!"Iiird edition)。
[0092] -方面，插入所述非人类哺乳动物中的人类重链基因座含有人类V、D和J区的所有 组成成分，在基因组中其与非人类哺乳动物恒定区功能性排列，由此在人类可变区与非人 类哺乳动物恒定区之间可W产生功能性嵌合抗体。全部插入的人类重链遗传物质在本文称 作人类IgH VDJ区，包含来自人类基因组的DNA，其编码编码人类V、D和J部分的所有外显子 及适当地也包含相关内含子。相似地，本文提及人类Ig轻链KV和J区是指包含编码人类基因 组的V和J区的所有外显子及适当地也包含相关内含子。本文提及人类Ig轻链W和J区是指 包含人类基因组的编码V和J区的所有外显子及适当地也包含相关内含子的人类DNA。
[0093] 人类可变区适当地插入在非人类哺乳动物恒定区上游，后者包含编码全部恒定区 或者所述恒定区足够部分所需的所有DNA，W形成能特异性识别抗原的有效的嵌合抗体。
[0094] 一方面，所述嵌合抗体或抗体链具有一部分宿主恒定区，足W提供在宿主哺乳动 物中天然发生的抗体中可见的一或多种效应物功能，例如其能与化受体相互作用和/或结 合补体。
[0095] 本文提及具有宿主非人类哺乳动物恒定区的嵌合抗体或抗体链因此不限于完整 恒定区，也包括具有所有宿主恒定区或者其足W提供一或多种效应物功能的一部分的嵌合 抗体或抗体链。运也适用于本发明的非人类哺乳动物和细胞及方法，其中人类可变区DNA可 插入宿主基因组中，由此形成具有全部或部分宿主恒定区的嵌合抗体链。一方面，全部的宿 主恒定区与人类可变区DNA可操纵地连接。
[0096] 本文所述宿主非人类哺乳动物恒定区优选是内源宿主野生型恒定区，位于合适的 重链或轻链的野生型基因座。例如，人类重链DNA适当地插入在小鼠染色体12上，适当地与 小鼠重链恒定区相邻。
[0097] 一方面，人类DNA如人类VDJ区的插入祀向于在小鼠基因组I巧基因座中J4外显子 与化基因座之间的区域，及一方面插入在坐标114,667，090与114,665,190之间，或者在坐 标114，667，091，在114，667，090之后。一方面，人类DNA如人类轻链KVJ的插入祀向于小鼠染 色体6中坐标70,673,899与70,675,515之间，适当地在位置70,674,734，或者在染色体16上 入小鼠基因座等价位置。
[0098] 一方面，形成嵌合抗体的宿主非人类哺乳动物恒定区可W在不同的(非内源)染色 体基因座。在运种情况中，插入的人类DNA如人类可变VDJ或VJ区然后可被插入非人类基因 组中，位于与天然发生的重链或轻链恒定区不同的位置。所述天然恒定区可W在与天然位 置不同的染色体基因座插入基因组中或者在基因组中复制，由此其与人类可变区功能性排 列，由此仍可产生本发明的嵌合抗体。
[0099] -方面，所述人类DNA插入在内源宿主野生型恒定区，位于宿主恒定区与宿主VDJ 区之间的野生型基因座。
[0100] 提及位于非人类哺乳动物恒定区上游的可变区的位置是指存在两个抗体部分可 变区与恒定区的合适的相对位置，W使得所述可变区与恒定区在哺乳动物体内形成嵌合抗 体或抗体链。因此，插入的人类DNA和宿主恒定区是彼此功能性排列的W产生抗体或抗体 链。
[0101] -方面，插入的人类DM通过同种型转换而能与不同的宿主恒定区一起表达。一方 面，同种型转换不需要或包含反式转换。人类可变区DNA插入在与相关宿主恒定区相同染色 体上意味着不需要反式转换W产生同种型转换。
[0102] 如上所述，用于现有技术模型的转基因基因座是人源的，因此即使在所述转基因 能互补小鼠基因座W便小鼠产生产生完全人类抗体的B细胞的情况中，各个抗体亲和性也 很少达到可得自完整（非转基因）动物的那些亲和性水平。主要原因是（除了上述所有组成 成分和表达水平之外)所述基因座的控制元件是人类的事实。因此，例如激活高亲和性抗体 超变和选择的信号传导成分被损害。
[0103] 相反，在本发明中，宿主非人类哺乳动物恒定区得W保持，且优选至少一个非人类 哺乳动物增强子或其他控制序列如转换区保持与非人类哺乳动物恒定区功能性排列，由此 如在宿主哺乳动物中所见的所述增强子或其他控制序列的作用在转基因动物中得W全部 或部分发挥。
[0104] 运种方法被设计为允许取样的人类基因座的完全多样性、允许与非人类哺乳动物 控制序列如增强子达到相同高的表达水平，及由此在B细胞中的信号传导例如使用转换重 组位点的同种型转换将仍使用非人类哺乳动物序列。
[0105] 具有运种基因组的哺乳动物将产生具有人类可变区与非人类哺乳动物恒定区的 嵌合抗体，但是运些抗体可易于例如在一个克隆步骤中人源化。此外，运些嵌合抗体的体内 效力可W在运些相同动物中评估。
[0106] -方面，插入的人类IgH VDJ区在种系构型中包含来自于人类的所有V、D和J区及 插入序列。
[0107] -方面，将800-1000化的人类IgH VDJ区插入非人类哺乳动物I巧基因座，及一方 面，插入940、950或960kb片段。适当地，运包括来自人类染色体14的碱基105,400,051-106， 368，585。一方面，插入的I巧人类片段由来自染色体14的碱基105，400，051-106，368，585组 成。一方面，插入的人类重链DNA如由来自染色体14的碱基105，400,051-106，368,585组成 的DNA插入在小鼠染色体12中小鼠J4区末端与化区之间，适当地在坐标114，667，090与114， 665，190之间，或者在坐标114，667，091，在114，667，090之后。一方面，所述插入在坐标114， 667,089与114,667,090之间（坐标参照小鼠C57BL/6J品系的NCBIm37)，或者在另一非人类 哺乳动物基因组的等价位置。
[0108] -方面，插入的人类KVJ区在种系构型中包含来自人类的所有V和J区及插入序列。 合适地，运包括来自人类染色体2的碱基88，940，356-89，857，000，适当地为大约91化b。另 一方面，所述轻链VJ插入物可包含仅V节段和J节段的近端簇(proximal cluster)。运种插 入物为大约473kb。一方面，人类轻链KDNA如来自人类染色体2的碱基88，940，356-89，857， 000的人类I排片段被适当地插入小鼠染色体6中坐标70,673,899与70,675,515之间，适当 地在位置70，674，734。运些坐标对于人类基因组是指NCBI36，ENSEMBL Re 1 ease 54，对于小 鼠基因组是指与小鼠品系巧7BL/6J相关的NCBIM37。
[0109] -方面，所述人类AVJ区在种系构型中包含来自人类的所有V和J区及插入序列。
[0110] 适当地，运包括来自人类染色体2的针对K片段选择的那些碱基的类似碱基。
[0111] 在一个实施方案中，本发明的细胞或非人类哺乳动物包含在小鼠染色体12坐标 114，666，183 与 114，666，725 之间如在 114，666，283 与 114，666，625 之间、任选地在坐标 114， 666,335与114,666,536之间、任选地在114,666,385与114,666,486之间或者在114,666， 425与114,666，446之间或者在11