小鼠骨髓杂交瘤细胞株、及其产生的单克隆抗体和应用
【技术领域】
[0001] 本发明设及犬攝热病毒小鼠骨髓杂交瘤细胞株、其产生的单克隆抗体，含单克隆 抗体的检测试剂盒和应用，属于生物技术领域。
【背景技术】
[0002] 犬攝热病毒(化nine distemper virus，CDV)属于副黏病毒科麻疹病毒属，病毒核 酸为单股RNA，病毒粒子呈圆形或不整形，有时呈长丝状。CDV对热和干燥敏感，在50-60°C溫 度下30分钟即可灭活，在炎热季节CDV在犬群中不能长期存活。在较冷的溫度下，CDV可存活 较长时间，在2-4°C可存活数周，在-60°C可存活超过7年。
[0003] 犬攝热病是由犬攝热病毒引起的，属于犬科、綻熊科和關科动物的一种急性、高度 接触性传染病，W双相热型发热、结膜炎、上呼吸道与肺及胃肠道卡他性炎症、皮炎、神经炎 和足垫硬化为特征。染病犬的死亡率高达30%-80%，严重影响犬及其它易感染动物的健 康，造成大批犬死亡，并可引起患病动物的严重后遗症，造成了严重的经济损失。
[0004] 目前，国内外犬攝热病毒检测方法包括电镜观察、亲和素-生物素-复合物法 (ABC )、免疫巧光法(IFA )、聚合酶链式反应法(PCR )，检测时需要昂贵的仪器设备和专业的 技术人员，从而限制了其在大规模筛查方面的应用，使得运些方法偏向于实验室诊断，不适 合基层或现场快速检测。基于此，亟需发展一种快速、简便、灵敏度高的检测方法。
【发明内容】
[0005] 为解决现有技术的不足，本发明提供了犬攝热病毒小鼠骨髓杂交瘤细胞株，其分 泌的抗犬攝热病毒单克隆抗体，可W有效地诊断、预防和/或治疗犬攝热病毒所引发的感 染;含所述抗犬攝热病毒单克隆抗体的检测试剂盒，可快速、简便、准确地检测犬攝热病毒 抗原。
[0006] 本发明设及一种小鼠骨髓杂交瘤细胞6E11株巧ybridoma-Ba化/c mouse spleen cells and Sp2/0,strain 6E11)，保藏号为CCTCC N〇:C2015202,保藏于中国典型培养物保 藏中屯、，保藏地址为中国武汉?武汉大学，保藏时间为2015年11月25日。
[0007] 本发明设及一种单克隆抗体，所述单克隆抗体重链可变区氨基酸序列为SEQ ID No. 2所示的氨基酸序列或该序列经过一个或多个氨基酸添加、删除、替换或修饰保守性突 变获得的保守性变异体;所述单克隆抗体轻链可变区氨基酸序列为SEQ ID No.4所示的氨 基酸序列或该序列经过一个或多个氨基酸添加、删除、替换或修饰保守性突变获得的保守 性变异体。
[000引本发明设及一种小鼠骨髓杂交瘤细胞1G5株巧ybridoma-Ba化/c mouse spleen cells and Sp2/0，s化ain 1G5)，保藏号为CCTCC N0:C2015201，保藏于中国典型培养物保 藏中屯、，保藏地址为中国武汉?武汉大学，保藏时间为2015年11月25日。
[0009]本发明设及一种单克隆抗体，所述单克隆抗体重链可变区氨基酸序列为SEQ ID No.6所示的氨基酸序列或该序列经过一个或多个氨基酸添加、删除、替换或修饰保守性突 变获得的保守性变异体;所述单克隆抗体轻链可变区氨基酸序列为SEQ ID No.8所示的氨 基酸序列或该序列经过一个或多个氨基酸添加、删除、替换或修饰保守性突变获得的保守 性变异体。
[0010] 本发明设及一种抗犬攝热病毒药物组合物，其中，所述药物组合物包含免疫量的 本发明的所述单克隆抗体或其可变区氨基酸序列制备的单链抗体，W及药学上可接受的载 体。
[0011] 本发明还设及犬攝热病毒检测试剂盒，所述检测试剂盒包括有效量的所述单克隆 抗体6E11和有效量的所述单克隆抗体1G5,还包括所述单克隆抗体和犬攝热病毒的抗原抗 体反应进行检测的检测试剂、阴性对照、阳性对照。
[0012] 本发明还设及所述抗犬攝热病毒药物组合物在制备预防和/或治疗犬攝热相关疾 病的药物中的应用。
[0013] 本发明还设及所述试剂盒在用于非诊断目的的犬攝热病毒检测中的应用，其中， 所述非诊断目的的犬攝热病毒检测包括流行病学分析、对离体组织进行定性和定量检测、 表位鉴定研究W及定性和定量鉴别检验含犬攝热病毒全病毒抗原和其他抗原的疫苗组合 物中的犬攝热病毒全病毒抗原。
[0014] 本发明的有益效果在于：
[0015] (1)本发明通过使用特异性高的抗犬攝热病毒单克隆抗体，制备的酶标记的犬攝 热病毒检测试剂盒在硝酸纤维素膜上完成了化ISA检测过程，实现了酶联免疫级联放大效 应，因此其灵敏度可W达到化ISA水平，并且操作仅需30分钟，较化ISA简便、快速、省时；
[0016] (2)本发明使用金标记的犬攝热病毒检测试剂盒敏感性高于市售进口胶体金检测 试纸条，提高了 CDV感染的检出率。
【附图说明】
[0017] 图1为酶免疫层析检测试纸条的侧面示意图，图中：1-硝酸纤维素膜，2-酶标垫，3-底物垫，4-吸水垫，5-展开液垫，6-检测线，7-质控线，8-底物缓冲液槽，9-底物缓冲液，10-支撑物，11-检测样品。
[0018] 图2为小鼠骨髓杂交瘤细胞株6E11和1G5分泌单克隆抗体6E11和1G5的聚丙締酷胺 凝胶电泳鉴定图，其中：泳道M为Marker;泳道1为单克隆抗体1G5,包括上端的重链和下端的 轻链;泳道2为单克隆抗体6E11，包括上端的重链和下端的轻链。
【具体实施方式】
[0019] W下，对本发明的实施方式进行说明。
[0020] 本发明设及小鼠骨髓杂交瘤细胞6E11株化ybridoma-Balb/c mouse spleen cells and Sp2/0,s1:rain 6E11)保藏于中国典型培养物保藏中屯、，保藏号为CCTCC No: C2015202,保藏地址为中国武汉?武汉大学，保藏时间为2015年11月25日。
[0021] 本发明的小鼠骨髓杂交瘤细胞6E11株由犬攝热病毒CVCC AV299株抗原免疫小鼠 后，取其脾细胞，与SP2/0骨髓瘤细胞融合，经筛选制得。
[0022] 术语"犬攝热病毒"（caninediStempervirus，CDV)在分类上属于副黏病毒科 (Paramyxoviridae)麻疹病毒属(MorbilIivirus)，是一种单链RNA病毒，可感染犬科、綻熊 科和關科动物，感染后W双相热型发热、结膜炎、上呼吸道与肺及胃肠道卡他性炎症、皮炎、 神经炎和足垫硬化为特征。
[0023] 本发明设及一种单克隆抗体，所述单克隆抗体重链可变区氨基酸序列为SEQ ID No. 2所示的氨基酸序列或该序列经过一个或多个氨基酸添加、删除、替换或修饰保守性突 变获得的保守性变异体;所述单克隆抗体轻链可变区氨基酸序列为SEQ ID No.4所示的氨 基酸序列或该序列经过一个或多个氨基酸添加、删除、替换或修饰保守性突变获得的保守 性变异体。
[0024] 术语"单克隆抗体"是指获自基本上同源的抗体群的抗体，即组成该群体的抗体个 体都相同，除了可能存在少量可能的自发突变。因此，修饰语"单克隆"是指该抗体的性质不 是离散抗体的混合物。优选地，所述单克隆抗体包括单价的或是单链抗体、双链抗体、嵌合 抗体、犬源化抗体W及上述抗体的衍生物、功能等同物和同源物，也包括抗体片段和含有抗 原结合结构域的任何多肤。抗体为涵盖具有所需特异性的结合结构域的任意特异性结合因 子，因而，运个术语涵盖了与之同源的抗体片段、衍生物、犬源化抗体W及抗体的功能等同 物和同源物，也包括含有抗原结合结构域的任何多肤，无论是天然的还是合成产生的。抗体 的实例是免疫球蛋白亚型（如IgG, I姐，IgM, I曲和IgA)及其亚型亚类;也可W是包含抗原结 合结构域的片段如化13、3。。￥^￥、(1413少(1;和双链抗体((11曰130(1163)。融合至另一多肤的、包 含抗原结合结构域的嵌合体分子或者等同物也包括在其中。嵌合抗体的克隆与表达在 EP. A. 0120694和EP. A. 0125023中描述。抗体可W通过许多方式修饰，可用DNA重组技术来产 生保留原来抗体特异性的其它抗体或嵌合分子。运种技术可W包括将编码抗体的免疫球蛋 白可变区或互补性决定区（CDRs)的DNA引入不同免疫球蛋白的恒定区或恒定区加框架区， 参见EP.A. 184187 ,GB2188638A或EP.A. 239400。还可W对杂交瘤细胞或产生抗体的其它细 胞进行遗传突变或其它改变，运不改变所产生抗体的结合特异性。用于本发明的"单克隆抗 体"也可用基因工程方法制得，因为编码本发明鼠源化抗体的DNA序列可用本领域技术人员 熟知的常规手段，如根据本发明公开的氨基酸序列人工合成或用PCR法扩增得到，因而也可 用重组DNA方法，可用本领域熟知的各种方法将该序列连入合适的表达载体中。最后，在适 合本发明抗体表达的条件下，培养转化所得的宿主细胞，然后本领域技术人员应用熟知的 常规分离纯化手段纯化得到本发明的单克隆抗体。抗体包含通过二硫桥连接在一起的多肤 链几何体，称为轻链和重链的两条多肤主链构成抗体的所有主要结构类别（同型物）。重链 和轻链都进一步可分为称作可变区和恒定区的一些亚区。重链包括单个的可变区和=个不 同的恒定区，轻链则包括单个可变区（不同于重链的可变区）和单个恒定区（不同于重链的 恒定区）。重链和轻链的可变区负责抗体的结合特异性。
[0025] 术语"重链可变区"是指一种多肤，其长度为110至125个氨基酸，其氨基酸顺序相 应于本发明单克隆抗体从重链N末端氨基酸开始的重链氨基酸顺序。同样，术语"轻链可变 区"是指一种多肤，其长度为95至115个氨基酸，其氨基酸顺序相应于本发明单克隆抗体从 轻链N末端氨基酸开始的轻链氨基酸顺序。本领域普通技术人员显然知晓，在本发明所具体 公开的单克隆抗体的重链可变区和轻链可变区氨基酸序列基础上，可W通过常规基因工程 和蛋白质工程方法进行一个或多个氨基酸的添加、删除、替换等修饰，获得其活性片段或保 守性变异体，而仍能够保持与犬攝热病毒特异性结合。本发明中的单克隆抗体还包括其活 性片段或保守性变异体。
[0026] 作为本发明的一种实施方式，所述单克隆抗体为单克隆抗体6E11，由所述小鼠骨 髓杂交瘤细胞6E11株分泌产生。
[0027] 所述单克隆抗体6E11重链可变区氨基酸序列为SEQ ID No. 2所示的氨基酸序列； 所述单克隆抗体6E11轻链可变区氨基酸序列为SEQ ID No.4所示的氨基酸序列。
[0028] 本发明的单克隆抗体6E11的相对亲和力常数为1:5120,也就是说，其与抗原的抗 原决定簇的结合强度非常高;所述单克隆抗体6E11IPMA(免疫过氧化物酶单层细胞试验)效 价为1:12800,与犬攝热病毒具有良好的反应性。
[00巧]本发明设及小鼠骨髓杂交瘤细胞1G5株(Hybridoma-Ba化/c mouse spleen cells and Sp2/0，strain 1G5)保藏于中国典型培养物保藏中屯、，保藏号为CCTCC N〇:C2015201， 保藏地址为中国武汉?武汉大学，保藏时间为2015年11月25日。
[0030] 本发明的小鼠骨髓杂交瘤细胞1G5株由犬攝热病毒CVCC AV299株抗原免疫小鼠 后，取其脾细胞，与SP2/0骨髓瘤细胞融合，经筛选制得。
[0031] 本发明设及一种单克隆抗体，所述单克隆抗体重链可变区氨基酸序列为SEQ ID No.6所示的氨基酸序列或该序列经过一个或多个氨基酸添加、删除、替换或修饰保守性突 变获得的保守性变异体;所述单克隆抗体轻链可变区氨基酸序列为SEQ ID No.8所示的氨 基酸序列或该序列经过一个或多个