一种新型β-葡聚糖酶及其制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于海洋微生物和酶制剂领域，具体设及一种新型0-葡聚糖酶及其制备方 法。
【背景技术】
[0002] 0-葡聚糖酶是一类能降解谷物中0-葡聚糖的水解酶，可应用于啤酒生产中。大麦 胚乳细胞壁的主要成分是e-葡聚糖，该酶能降解e-葡聚糖分子中的e-1，3和0-1，4糖巧链， 使之降解为小分子，失去亲水性，降低粘性，从而疏松大麦胚乳细胞壁，提高大麦利用率，使 麦芽汁粘度降低，大大缩短麦芽汁和啤酒的过滤时间，增加啤酒产量，改善啤酒的质量。在 W大麦、小麦、黑麦、燕麦等谷物为畜禽的饲料中含有大量的e-葡聚糖，由于动物(少数反当 动物除外)体内没有消化e-葡聚糖的酶，e-葡聚糖作为一种非淀粉粘性多糖，在肠道内具有 较高的粘度，阻止营养物质的吸收，降低了饲料的营养价值。e-葡聚糖酶应用于饲料中，大 大提高了饲料的利用率。纤维寡糖具有调节肠道微生物菌群作用，是一种功能性寡糖，由于 它不易使血糖浓度升高，可作为糖尿病患者的甜昧剂等。目前制备功能性寡糖的方法有酶 水解法、酶合成转化法、酸水解法、碱转化法及化学合成法等。但酸水解法、化学合成法等工 艺操作复杂、耗能大，产率低，难于实现生产规模化;而采用e-葡聚糖酶水解小麦賴杆生产 功能性寡糖，操作工艺简便，可大大降低生产成本，提高小麦賴杆的利用率，减少生物质资 源的浪费，减少由于賴杆焚烧带来的空气污染问题，具有较大的社会经济价值和环境价值。 含有大量e-i ,3-葡聚糖的酿酒酵母自溶性残渣多作为工业废物或W低廉的价格作为饲料 销售，造成了很大的资源浪费和环境污染。利用e-葡聚糖酶处理使葡聚糖水解为寡糖或还 原糖，可提高其水溶性，且反应条件溫和，无毒安全，避免了使用酸碱、机械等方法破壁带来 的污染、产物失活等问题。谷氨酸菌体是一种单细胞蛋白，味精厂的发酵废液中含有大量的 谷氨酸菌体，造成严重的环境污染且浪费了大量的蛋白质，利用蛋白酶和e-葡聚糖酶水解 蛋白质，反应条件溫和，能耗低，副反应少，可获得复合氨基酸水解液，又减少了化学法带来 的环境污染问题。真菌细胞壁多糖主要由几下质（甲壳质）、纤维素、葡聚糖、甘露聚糖等构 成，e-葡聚糖酶可W水解真菌细胞壁，可W在生物防治中对植物病原真菌产生括抗作用，在 生物防治中具有重要的意义。孙维国等利用李氏木霉作为菌种，W微晶纤维素、玉米浆、憐 酸二氨钟、硫酸锭和碳酸巧为原料，进行液体深层发酵生产e-葡聚糖酶，极大的降低了生产 成本，产品主原料成本降低83.3% (申请公布号:CN101993865A)。江正强等利用枯草芽抱杆 菌(Bacillus subtilis)TT-68(保藏编号为CGMCC No. 3340)通过摇瓶发酵培养，产酶水平 为430-3000U/mU进行化发酵罐扩大培养30h，酶活可达到2500-5000U/mL(申请公布号： CN101845423A)〇
【发明内容】
[0003] 本发明要解决的技术问题是提供一种新型0-葡聚糖酶及其制备方法。
[0004] 一种海洋芽抱杆菌N6-2(BaciIlus SP.N6-2)，该菌株能够产生一种新型0-葡聚糖 酶，该海洋芽抱杆菌N6-2于2014年11月23日保藏于中国武汉典型培养物保藏中屯、，保藏号 为CCTCC NO:M2014586。
[0005] 本发明还提供一种新型0-葡聚糖酶，该新型0-葡聚糖酶由海洋芽抱杆菌N6-2产 生，分子量为24kDa，所述新型0-葡聚糖酶N端由15个氨基酸组成，其氨基酸序列为STGGS FYEW 順YNT。
[0006] 进一步，所述海洋芽抱杆菌N6-2产生的新型0-葡聚糖酶的制备方法:海洋芽抱杆 菌N6-2菌株，接种于含有种子培养基的试管中，在15-36°C的摇床中100-3(K)rpm，培养25-30h;将上述培养后的菌株按2-6% (v/v)的接种量接种于盛有发酵培养基的摇瓶中，15-36 °C，100-300rpm，发酵培养48-9化;取菌株发酵液，离屯、，除掉发酵液中的菌体和杂质，并调 节其抑在6.5-7.5，即为粗制发酵样品；超滤法粗提，获得10~30kDa组分，用硫酸锭沉淀法 获得硫酸锭饱和浓度在30 % -65 %的组分，将30 % -65 %的组分过Q离子交换层析柱，将穿透 峰Ql脱盐后真空冷冻干燥保存，将收集的穿透峰Ql，过CM离子交换柱，收集穿透峰Cl，脱盐 后真空冷冻干燥保存，即为海洋芽抱杆菌N6-2所产生的新型0-葡聚糖酶。
[0007] 进一步，所述的种子培养基的成分及终浓度：牛肉膏0.2-0.8%，蛋白腺1-2%，氯 化钢 0.3-1%，P册.8-7.5。
[000引进一步，所述的发酵培养基的成分及终浓度:薦糖0.5-1%，牛肉膏0.2-0.8%，蛋 白腺1-2%，氯化钢0.3-1 %，矿物油0.5-1%0，P册.8-7.5。
[0009] 本发明还提供一种新型0-葡聚糖酶的制备方法，其步骤为：
[0010] (1)菌株的发酵：
[0011] 取海洋芽抱杆菌N6-2菌株，接种于含有种子培养基的试管中，在15-36°C的摇床中 100-300巧m，培养25-30h;
[0012] 将上述培养后的菌株按4% (v/v)的接种量接种于盛有发酵培养基的摇瓶中，15-36°C，100-300rpm，发酵培养48-9化;取菌株发酵液，离屯、，除掉发酵液中的菌体和杂质，并 调节其pH在6.5-7.5，即为粗制发酵样品。
[001引（2)超滤截留
[0014] 取海洋芽抱杆菌N6-2发酵液，在SOOOrpm下离屯、，除掉菌体与部分杂质。依次用分 子量为501^)曰、301^)曰、101^)曰、化1)曰、31^)曰的滤膜，截留发酵液，获得10~301^)曰的组分，调节抑 值至7.0;
[0015] 进一步，所述的种子培养基的成分及终浓度：牛肉膏0.2-0.8%，蛋白腺1-2%，氯 化钢 0.3-1%，P册.8-7.5。
[0016] 进一步，所述的发酵培养基的成分及终浓度:薦糖0.5-1%，牛肉膏0.2-0.8%，蛋 白腺1-2%，氯化钢0.3-1 %，矿物油0.5-1%〇，P册.8-7.5。
[0017] (3)硫酸锭沉淀法粗提
[0018] 取步骤(2)所述的10~30kDa组分，置于冰浴之中，缓慢向其中加入硫酸锭固体粉 末，使其水溶液浓度达到30%，4°C静置化，1000 Orpm离屯、，沉淀作为杂蛋白，遗弃；取上清 液，向其中缓慢加入硫酸锭固体粉末，使其水溶液浓度达到65 %，4°C静置化，1000 Orpm，离 屯、，弃上清，取沉淀;沉淀用5〇111111〇1/1的抑7.96^径甲基氨基甲烧盐酸盐(化13-肥1)缓冲液 溶解，装入3W)a透析袋，置于相同缓冲液中透析，地、化、1化换一次缓冲液，既得到硫酸锭饱 和浓度在30 % -65 %的组分。
[0019] (4)Q离子交换层析
[0020] 取步骤(3)所述的硫酸锭饱和浓度30%-65%的组分，过Q离子交换层析柱，上样缓 冲液为20-60111111〇1/1的口册.0-8.0^径甲基氨基甲烧盐酸盐(化13-肥1)缓冲液，每次上样量 为5-20mL，洗脱液为含Imol/L化Cl的上样his-肥1缓冲液，洗脱液W100 %(v/v)的浓度进 行洗脱，流速为3mL/min，检测波长为280nm，收集穿透峰Ql，脱盐后真空冷冻干燥保存；
[0021] 进一步，上述步骤(4)中的上样缓冲液优选为50mmol/L，pH7.96。
[0022] 进一步，上述步骤(4)中每次上样量优选为5mL。
[0023] (5)CM离子交换层析
[0024] 取步骤（4)中收集的穿透峰Q1，过CM离子交换柱，上样缓冲液为20-60mmol/L的 P册.0-9.0氨氧化钢甘氨酸缓冲液(化OH-Glycine),每次上样量为I-10mL洗脱液为含Imol/ L化Cl的氨氧化钢甘氨酸上样缓冲液，洗脱液W100 %(v/v)的浓度进行洗脱，流速为3mL/ min,收集穿透峰Cl,脱盐后真空冷冻干燥保存，即为海洋芽抱杆菌N6-2所产生的新型(6-葡 聚糖酶。
[002引进一步，上述步骤(5)中的上样缓冲液优选为25mmol/L，pH9.0;
[00%] 进一步，上述步骤(5)中每次上样量优选为2mL。
[0027] 本发明还设及该酶在工业中的应用，如酿酒工业，工业废水处理等。本发明还设及 该酶在食品行业中的应用，如魔芋等饮品的制备。本发明还设及该酶在饲料方面的应用。
【附图说明】
[0028] 图1.海洋芽抱杆菌N6-