一种低β-葡萄糖苷酶纤维素酶添加剂的制备方法
【专利说明】
【技术领域】
[0001]本发明涉及添加剂的技术领域，特别涉及一种低β-葡萄糖苷酶纤维素酶添加剂的制备方法。
【【背景技术】】
[0002]纤维素水解可得纤维低聚糖，纤维低聚糖在水中有一定的溶解度，在有机溶剂中微溶或者不容，纤维低聚糖是功能性低聚糖，可促进矿物质吸收、为双歧杆菌增殖因子、降低血清胆固醇、增强机体免疫力、抵抗肿瘤等独特的生理功能，是人、动物、植物等具有特殊生理作用的低聚糖，可广泛应用于食品和饲料工业。
[0003]纤维素酶是一类能够水解纤维素的β-l，4_葡萄糖苷键生成葡萄糖的多组分酶的总称，传统上传统上将其分为3类:内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶和β_葡萄糖苷酶。纤维素酶在降解纤维素的过程中，纤维素酶组分中的葡萄糖苷酶主要在液相中发生作用，而水解得到的纤维低聚糖也主要溶解在液相中，葡萄糖苷酶会进一步水解纤维低聚糖，释放出葡萄糖作为产物。
[0004]目前，采用里氏木霉纤维素酶应用于降解纤维素制备纤维低聚糖，尽管里氏木霉纤维素酶系中的葡萄糖苷酶活力较低，但是产物中葡萄糖含量依然很高，需要将其中的葡萄糖苷酶组分分离除去，以减少或消除葡萄糖苷酶对生成的纤维低聚糖进一步降解。
[0005]现有技术中，从里氏木霉纤维素酶系中分离除去β_葡萄糖苷酶的一个较好的方法是应用层析分离法，但是层析分离法成本较高，不适合工业化生产，因此寻找经济可行的、可工业化的一种低葡萄糖苷酶纤维素酶添加剂的制备方法，是十分必要的。
【
【发明内容】
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[0006]本发明的目的在于克服上述现有技术的不足，提供一种低β_葡萄糖苷酶纤维素酶添加剂的制备方法，其旨在解决现有技术中纤维素酶降解纤维素得到纤维低聚糖的产量较低，且应用层析分离法去除葡萄糖苷酶成本较高，不适合工业化生产的技术问题。
[0007]为实现上述目的，本发明提出了一种低β_葡萄糖苷酶纤维素酶添加剂的制备方法，包括如下步骤:
[0008]步骤一、选取菌种:选取木霉属中的里氏木霉作为生产纤维素酶的菌株；
[0009]步骤二、制备斜面孢子:将选取的里氏木霉接种至PDA斜面培养基中，并置于生化培养箱中，在温度为24?30°C、相对湿度为95?97%的恒温恒湿暗环境下培养5?7天，直至里氏木霉菌丝表面形成一层分生孢子层，于4°C温度下保存备用；
[0010]步骤三、制备孢子悬液:用无菌水洗下步骤二处理得到的分生孢子，并稀释孢子浓度至18个/mL，备用；
[0011]步骤四、制备种子液:在250mL的三角瓶中装入50mL液态种子培养基，并用纱布封口，灭菌处理后，在无菌环境中取ImL经步骤三得到的孢子悬液接种至液态种子培养基中，然后置于恒温培养振荡器中培养2?3天，使孢子萌发得到纤维素酶种子液，备用；
[0012]步骤五、制备发酵料:将秸杆、稻草、麦麸等纤维原料粉碎至20目以下，预处理并灭菌处理后冷却，得到无菌发酵料；
[0013]步骤六、发酵产酶培养:将步骤四得到的种子液与步骤五得到的无菌发酵料以质量比为1:10?12的比例均匀接种至液体培养基中，接种量为4?5%，并按照50?60%的装入量装入发酵罐中，发酵罐中的发酵液初始PH值控制在4?7、温度控制在28?32°C进行发酵产酶处理，发酵时间为72?96小时；
[0014]步骤七、制备纤维素酶液:将经过步骤六处理得到的发酵液在离心机中离心处理，得到纤维素酶液，备用；
[0015]步骤八、吸附脱附处理:取经步骤七得到的纤维素酶液与纤维吸附基质以一定的比例混合加入离心机中，并加入2?4倍水静置，静置一段时间后，开启离心机离心脱附处理，去除液相中的葡萄糖苷酶；
[0016]步骤九、后处理:取出经步骤八处理后的离心机中的低β-葡萄糖苷酶的物料，可直接用作绿色饲料添加剂进行饲喂，纤维低聚糖含量高。
[0017]作为优选，所述步骤二中的TOA固体培养基的制备方法:新鲜去皮马铃薯200g，切小块，加蒸馏水至lOOOmL，沸水煮30min后用纱布过滤，添加葡萄糖20g、琼脂粉18?20g，加热至琼脂溶化后加蒸馏水至100mU分装至无菌试管中，于121°C温度下灭菌30min，倾斜静置，凝固后备用。
[0018]作为优选，所述的步骤四中的恒温培养振荡器的温度设定在24?32°C，旋转频率为180?260r/min。
[0019]作为优选，所述的步骤六发酵过程中从发酵罐底部通入净化后的无菌空气，进行气流搅拌。
[0020]作为优选，所述的步骤六中接种量为4%，发酵温度为30°C，发酵时间为96小时。
[0021]作为优选，所述的步骤六中接种量为5%，发酵温度为32°C，发酵时间为72小时。
[0022]作为优选，所述的步骤八中的纤维吸附基质包括低聚木糖生产废渣。
[0023]作为优选，所述的步骤八中离心机内的温度为10°C，pH值为7.0，静置时间为30mino
[0024]本发明的有益效果:与现有技术相比，本发明提供的一种低β-葡萄糖苷酶活力纤维素酶的制备方法，采用里氏木霉生产制备纤维素酶，其中的葡萄糖苷酶活性较低，减缓了葡萄糖苷酶对纤维素的进一步降解作用，防止生成的纤维低聚糖进一步被降解成葡萄糖，采用液态深层发酵法生产，具有培养条件容易控制、不易染杂菌、生产效率高的特点，可工业化大规模生产，改善了目前国内绝大部分纤维素生产厂家均采用固体发酵法生产纤维素酶，发酵水平不稳定，生产效率较低，不适合大规模生产的现状，采用低聚木糖生产废渣等作为纤维吸附基质，资源利用率高，并通过吸附脱附处理后，拆分去除溶于液相中的葡萄糖苷酶，进一步降低了纤维素酶中葡萄糖苷酶的含量，且吸附的脱附处理的温度为10°C，pH值为7.0，静置吸附时间为30min，大大提高了内切葡聚糖酶吸附率与β-葡萄糖苷酶吸附率的比值，提高了饲料中纤维低聚糖的含量。
[0025]本发明的特征及优点将通过实施例结合附图进行详细说明。【【附图说明】】
[0026]图1是温度对低聚木糖生产废渣吸附纤维素酶组分的影响分析图；
[0027]图2是pH对低聚木糖生产废渣吸附纤维素酶组分的影响分析图；
[0028]图3是时间对低聚木糖生产废渣吸附纤维素酶组分的影响分析图。
【【具体实施方式】】
[0029]为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明了，下面通过附图中及实施例，对本发明进行进一步详细说明。但是应该理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限制本发明的范围。此外，在以下说明中，省略了对公知结构和技术的描述，以避免不必要地混淆本发明的概念。
[0030]本发明实施例提供一种低β-葡萄糖苷酶纤维素酶添加剂的制备方法，包括如下步骤:
[0031]步骤一、选取菌种:选取木霉属中的里氏木霉作为生产纤维素酶的菌株。
[0032]步骤二、制备斜面孢子:将选取的里氏木霉接种至PDA斜面培养基中，并置于生化培养箱中，在温度为24?30°C、相对湿度为95?97%的恒温恒湿暗环境下培养5?7天，直至里氏木霉菌丝表面形成一层分生孢子层，于4°C温度下保存备用。
[0033]其中，PDA固体培养基的制备方法:新鲜去皮马铃薯200g，切小块，加蒸馏水至100mU沸水煮30min后用纱布过滤，添加葡萄糖20g、琼脂粉18?20g，加热至琼脂溶化后加蒸馈水至lOOOmL，分装至无菌试管中，于121°C温度下灭菌30min，倾斜静置，凝固后备用。
[0034]步骤三、制备孢子悬液:用无菌水洗下步骤二处理得到的分生孢子，并稀释孢子浓度至108个/mL，备用。
[0035]步骤四、制备种子液:在250mL的三角瓶中装入50mL液态种子培养基，并用纱布封口，灭菌处理后，在无菌环境中取ImL经步骤三得到的孢子悬液接种至液态种子培养基中，然后置于恒温培养振荡器中培养2?3天，使孢子萌发得到纤维素酶种子液，备用。
[0036]其中，恒温培养振荡器的温度设定在24?32°C，旋转频率为180?260r/min。
[0037]步骤五、制备发酵料:将秸杆、稻草、麦麸等纤维原料粉碎至20目以下，预处理并灭菌处理后冷却，得到无菌发酵料。
[0038]步骤六、发酵产酶培养:将步骤四得到的种子液与步骤五得到的无菌发酵料以质量比为1:10?12的比例均匀接种至液体培养基中，接种量为4?5%，并按照50?60%的装入量装入发酵罐中，发酵罐中的发酵液初始PH值控制在4?7、温度控制在28?