一种草酸脱羧酶及草酸脱羧酶的重组表达方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及一种新的低抑环境下稳定且高效的草酸脱簇酶，W及草酸脱簇酶的重 组表达方法。
【背景技术】
[0002] 草酸(oxalic acid)是一种分子式为C2〇边2、分子量为90.04的二元有机酸，存在于 常见的绝大多数食物中，在特定食物(如渡菜或其它绿色蔬菜、绿茶、可可豆，豆浆，咖啡等） 中含量很高。草酸在生物体内为最终产物，不能被进一步分解，主要排泄方式是随尿液一起 排出。人体中的草酸包括外源性草酸和内源性草酸，外源性草酸是指通过饮食摄入的草酸， 内源性草酸是指人体肝脏自身代谢产生的草酸，正常人体内的外源性草酸和内源性草酸的 含量基本相同。某些肾结石高发人群则外源性草酸远远大于内源性草酸。
[0003] 人体内血液和尿液中的草酸含量过高时，容易与巧离子形成不溶性的草酸巧晶 体，草酸巧晶体很容易在膀脫、肾脏等器官内沉积形成结石。n型高草酸尿症是指食源性草 酸吸收异常，导致尿草酸较正常人偏高，是原发性高草酸尿症外导致结石的重要因素，因 此，控制从饮食中摄取的草酸，很大程度上就可W降低尿草酸量，从而降低患结石风险。低 草酸饮食或降解食物中草酸的防治草酸巧结石的策略在医学界已成为共识。饮食中草酸主 要在胃中被释放出来，浓度也相对较高，非常有利于酶法降解去除，但是胃中的低pH环境及 胃蛋白酶对草酸降解酶的活力有很大的挑战，因此寻找在低pH条件下能高效降解草酸的酶 成为此治疗技术的关键。
[0004] 目前已发现的具有分解草酸功能的酶，有草酸脱簇酶（W下简称"0XDC")、草酸氧 化酶和草酷CoA脱簇酶。OXDC的作用是催化草酸分解为甲酸和二氧化碳。迄今已知，已有报 道的OXDC主要来自芽抱杆菌（Ba Ci Ilus)属、曲霉（Aspergillus)属、金针茹 (Flammulinavelutipes)，云芝（Coriolus versicolor)，白腐菌（Trametes versicolor) 等。草酸脱簇酶在上述物种中的表达量极低，而且多数菌种生长缓慢，成分复杂，分离提取 纯化十分困难，不具备商业化应用可能，所W将草酸脱簇酶进行重组表达生产成为其商业 化应用的必然选择。目前草酸脱簇酶中实现原核重组表达的是枯草芽抱杆菌属的Yv巧基因 来源0XDC，并对其进行酶学性质的解析，但是其酶活力范围为PH3.0~6.0,低于3.0无活力。 金针茹来源的OXDC有通过烟草表达成功过报道，但表达量极低，同时也进行了原核 化.coli)表达但无酶活力（参见文献：Meenu Kesa;rwani，et.al Oxalate Decarboxylase from Collybia velutipes，T肥 J抓RNAL OF BIOLOGICAL C肥MISTRY，2000)，其他种属或 基因来源OXDC，尤其是真核生物的OXDC，尚未发现有成功进行重组表达的报道，尤其是用大 肠杆菌系统进行重组表达的。
【发明内容】
[0005] 为了解决现有技术中低抑(抑<3.0)稳定且有活力的OXDC无法进行大肠杆菌重组 表达运一技术问题，本发明通过高通量筛选，获得了多个在胃肠道环境下(pH 1.5~7.5)均 有较高草酸降解酶活力，且在低抑胃环境(pH 1.5~3.0)有高活力的草酸脱簇酶，并克隆得 到其编码基因通过改造实现了其重组表达。本发明的另一个目的是提供了低抑稳定且有活 力的OXDC的大肠杆菌重组表达方法。
[0006] 本发明提供的一种草酸脱簇酶，其为通过大肠杆菌表达系统进行重组表达，并在 pH<3.0时稳定且有活力;表达过程中该草酸脱簇酶的蛋白序列较原生酶蛋白序列缺失信 号肤片段。重组表达时，将运些草酸脱簇酶信号肤部分的DNA序列去除，使得改造后的基因 不含信号肤编码序列，实现了大肠杆菌重组表达，克服了现有技术中对于pH<3.0时稳定且 有活力的草酸脱簇酶无法通过大肠杆菌表达系统生产的问题，降低了生产成本。
[0007] 所述的pH<3.0时稳定且有活力，是指在抑低于3.0的环境下仍然有活力，并且酶 功能稳定。该草酸脱簇酶，优选在抑<2.8,抑<2.6, pH< 2.4,抑<2.2,抑<2.0,抑<1.8或 抑<1.5环境下稳定且有活力。
[0008] 本发明还提供一种可食用组合物，其含W上所述的草酸脱簇酶，用于预防和/或治 疗原发性高草酸尿症、II型高草酸尿症、肠源性高草酸尿症及含草酸巧泌尿结石疾病中的 一种或多种。由于本发明的草酸脱簇酶在低抑(抑<3.0)环境下仍然具有较高的酶活且活 性稳定，因此可W用于制备预防和/或治疗上述多种疾病的可食用组合物。
[0009] 优选地，上述可食用组合物为药物组合物、保健食品或特殊医学用途配方食品。所 述的特殊医学用途配方食品主要是为了满足进食受限、消化吸收障碍、代谢素乱或特定疾 病状态人群对营养素或膳食的特殊需要，专口加工配制而成的配方食品。该类产品必须在 医生或临床营养师指导下，单独食用或与其他食品配合食用。
[0010] 本发明还提供了一种食品添加剂，其含W上所述的草酸脱簇酶，用于制备低草酸/ 无草酸的食品或饮料。
[0011] 本发明还提供了一种草酸脱簇酶的重组表达方法，适用于pH<3.0时仍有活力的 草酸脱簇酶的表达生产，其是将优化后草酸脱簇酶编码基因的DNA片段与大肠杆菌表达载 体按照3~9:1的摩尔比混合进行连接，构建重组表达载体，重组表达载体转化D册a感受态 细胞;通过PCR及测序验证来筛选构建成功的重组表达载体转化菌，培养后抽取重组表达载 体，转化含有分子伴侣的大肠杆菌表达菌株，进行15~3(TC的低溫培养并诱导蛋白表达。 [00 12] 该重组表达方法，优选适用于在抑<2.8,抑<2.6，pH<2.4,抑<2.2,抑<2.0,抑 <1.8，pH<l. 5环境下稳定且有活力的草酸脱簇酶的表达生产。
[0013]感受态细胞(competent cells)是一种具有摄入外源DNA能力的受容菌，它可W摄 取外源的质粒DNA等。
[0014] pH<3.0时仍有活力的草酸脱簇酶在大肠杆菌中通常无法表达，本发明通过对含 有其编码基因的DNA片段进行优化处理，并在表达菌株中增加分子伴侣来实现其在大肠杆 菌中的表达，提供了另一条简便的生产途径。
[0015] 优选地，上述草酸脱簇酶的重组表达方法中，所述的优化包括删除草酸脱簇酶编 码基因DNA片段的信号肤片段;或删除草酸脱簇酶编码基因DNA片段的信号肤片段并在C端 融合助溶标签;或删除草酸脱簇酶编码基因DNA片段的信号肤片段并在C端融合助溶标签W 及进行密码子优化;或对草酸脱簇酶编码基因DNA片段进行密码子优化和删除信号肤片段。
[0016] 所述密码子优化是将其密码子更换为更加适合于大肠杆菌表达的密码子，信号肤 是影响低抑稳定且有活力的草酸脱簇酶表达的关键因素，因此编码信号肤部分的基因必须 去除，才能实现其在大肠杆菌表达系统的正常表达;融合助溶标签能够大大提高表达蛋白 的溶解性，降低包涵体的形成，提高生产效率。
[0017] 优选地，上述草酸脱簇酶的重组表达方法中，所述助溶标签为多聚谷氨酸片段，多 聚天冬氨酸片段，多聚赖氨酸片段，多聚谷氨酷胺片段和多聚天冬酷胺片段中的任意一种， 或者由谷氨酸、天冬氨酸、天冬酷胺、赖氨酸和谷氨酷胺五种氨基酸随机组合的片段。随机 组合是指五种氨基酸残基的排列和数量的随机搭配。
[0018] 优选地，上述草酸脱簇酶的重组表达方法中，所述表达载体为乳糖诱导表达载体、 半乳糖诱导表达载体、IPTG诱导表达载体、热诱导表达载体或者冷诱导表达载体。通过诱导 表达，能够准确控制表达过程。
[0019] 优选地，上述草酸脱簇酶的重组表达方法中，所述大肠杆菌表达菌株为化2UBL21 (DE3)、K12、K12(DE3)、0;rigami、0;rigami(DE3) 'Origami B'Origami B(DE3) 'Rosetta或 Roset1:a(DE3)。
[0020] 其中，Origami B(DE3)是衍生自IacZY突变的化21菌株，运个突变能根据IPTG的浓 度精确调节表达产物，使得表达产物量呈现IPTG浓度依赖性。
[0021 ] Rosetta(DE3)(Roset1:a Competent Cell(DE3))是采用大肠杆菌Rosetta菌株经 特殊工艺处理得到的大肠杆菌化学感受态细胞，具有氯霉素抗性，补充大肠杆菌缺乏的6种 稀有密码子(AUA，AGG，AGA，CUA，CCC，GGA)对应的tRNA，提高外源基因，尤其是真核来源的草 酸脱簇酶基因在大肠杆菌表达系统中的表达水平。
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