根特异性表达AhOda启动子及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明设及生物技术领域，特别是设及根特异启动子，其克隆、功能验证其应用。
【背景技术】
[0002] 栽培花生(AracMs hypogaea L.)属于豆科作物，是世界重要的油料作物和经济 作物，2015年，我国花生产量达1670万吨，居世界首位。花生的产量受到一些生物和非生物 胁迫的影响，尤其是地下害虫、真菌、细菌等。近年来花生田地下害虫发生猎獄，严重影响了 花生的产量和品质，造成花生大面积减产。
[0003] 地下害虫是指生活史中某一阶段危害植物近±表主茎、根、种子的杂食性害虫，造 成植物根系受损，影响植物吸收水分和无机盐，导致植物生长迟缓，甚至死亡。地下害虫的 种类很多，主要有蛇蜡、峻姑、金针虫等。其中蛇蜡是危害我国主要的地下害虫，也是重要的 世界性害虫，在印度、日本、美国等国都曾造成作物的减产，危害玉米、花生、甘馨、大豆、李 子等。
[0004] 蛇蜡是銷翅目金龟子科（Scarabaeoidae)幼虫的总称，W植食性蛇蜡危害最为广 泛。一般造成的花生减产为1~2成，严重地块达5成W上，甚至颗粒无收。山东新泰市农业局 数据显示，2008~2011年期间花生芙果平均受害率分别为15%、25%、28%、35%，呈逐年增 加趋势，个别地块因蛇蜡危害几乎绝产，造成重大的经济损失。2008年，贵州高尔夫球场蛇 蜡暴发成灾，草坪草失绿、萎黨、根系坏死，导致草坪草大片枯死。
[0005] 目前，主要用物理防治、化学防治和生物防治=种手段防治地下害虫蛇蜡。物理防 治主要是根据成虫的趋光性，用黑光灯诱杀成虫，但对幼虫没有什么效果。进行化学防治 时，使用巧喃丹、乐斯本、辛硫林、嚷虫胺化学药剂进行的防治，虽然毒杀蛇蜡的效果很好， 但同时也存在一定的弊端。首先，化学药剂严重的污染环境;其次，有些杀虫剂是高残留的， 直接危害到人类的健康，尤其是施用的农民，更有致残甚至致死的情况。
[0006] 用于生物防治的主要有线虫、病原真菌、病原细菌等。虽然对运些生物的防治有较 长的研究历史，但并没有广泛的应用。究其原因，一方面有些生物本身具有致病性，导致花 生染病;另一方面，如线虫的批量生产、储藏溫度、储藏时间等都会对防治效果产生影响，病 原真菌及细菌中的大部分容易受到环境的影响等。为实现蛇蜡的绿色防控，急需开辟新的 防治途径。随着生物技术的发展，应用分子手段培育抗虫害花生新品种，已成为目前新的防 治途径。
[0007] W生物防治、抗性作物品种及通过轮作控制害虫生长环境为基础的综合害虫防 治，已经在世界范围广泛应用，运主要归功于抗性作物品种的发展，而生物技术在培育抗性 品种方面起到了重要的作用。抗虫基因主要有=大类，植物源杀虫基因（班豆膜蛋白酶抑制 剂(CpTI)基因，植物次生代谢物等）；动物源杀虫基因（几下质酶基因，蜘蛛毒素基因等）；微 生物源杀虫基因（苏云金芽胞杆菌(Bt)杀虫晶体蛋白基因，胆固醇氧化酶基因等）。国内外 对抗虫害转基因花生的研究起步较晚，目前应用的抗虫基因也主要集中在微生物源杀虫基 因。
[0008] 目前，组织特异性启动子被广泛应用于基因工程。通过基因工程手段将组织特异 表达的启动子与抗病基因相连，使抗病基因在特定部位定时、高效表达，达到防治病虫害的 目的，为农民提供更多的生态安全和安全管理策略的机会。
[0009] 植物根系是重要的地下器官，可吸收水分、无机盐等W供植物正常生长所需;植物 根部的一些抗逆性基因表达的抗性蛋白等，会减缓一些生物及非生物胁迫对植物的影响， 使地上部分免受重金属、干旱、致病菌等的危害。现有技术中已克隆到一些对蛇蜡高毒力的 cry8类基因，而蛇蜡主要哨食花生的地下部分，所W寻找在整个花生生长季都高效表达的 根特异启动子，驱动cry8类基因在花生根中高效、特异表达，达到防治蛇蜡的作用，不仅可 W实现了蛇蜡的绿色防控，而且为改良花生品质、培育抗地下害虫花生新品种提供重要分 子基础。
[0010] 崔珊珊(崔姗姗，乔亚科，李桂兰，等.黑芥子酶基因pyklO根特异启动子在番茄中 的验证[J].生物技术通报，2012( 11): 73-77.)等用PkylO-GUS融合的植物表达载体转化番 茄后进行GUS染色后发现，pyklO启动子驱动GUS基因在根部特异表达。Van曲an (Vau曲an SP,James DJ,Lindsey K,et al.Characterization of FaRBT,a near root-specific gene from strawberry(FragariaXananassa Duch.)and promoter activity analysis in homologous and heterologous hosts.J Exp Bot[J]. Journal of Experimental Botany，2006，57(14): 3901-3910.)等发现草替化RB7启动子为根特异启动子，为作物基因 工程提供了一个有价值的根特异性启动子。Cu(Cu R，ZhaoL，Zhang Y，et al. Isolation Of a maize beta-gulcosidase gene Pormoter[J]. Plant Cel !Reports ,2006,25:1157-1168.)等克隆了玉米的Zmglul启动子，之后发现，该启动子驱动GUS基因在玉米根中的表达 量最高。目前已克隆获得很多根特异启动子，其来源包括烟草、水稻、玉米、拟南芥、番茄、大 豆等，但是花生根特异启动子报道比较罕见。
【发明内容】
[0011] 本发明基于转录组测序构建了基因数字表达谱的分析结果克隆花生根部特异表 达的启动子，可使目的基因在根部特定表达，在使用方面无后顾之忧。
[0012] 本发明克隆花生根特异启动子，并通过截短实验确定启动子核屯、区域，验证各启 动子的功能，为我国花生生物技术应用与发展奠定基础;为获得双价抗蛇蜡花生品种提供 高效、稳定、特异表达的启动子提供重要分子基础。
[0013] 根特异性表达启动子，其核巧酸序列如沈Q ID NOUSEQ ID N02或沈Q ID N03所 /J、- O
[0014] -种表达载体，含有上述特异表达启动子。
[0015] 上述的表述载体在转基因植物中的应用。
[0016] 所述的应用，该表达载体中插入有抗虫基因，将该表达载体转入植物中，使其根中 表达该抗虫基因，W防治地下害虫。
[0017] 上述根特异性表达启动子在转基因植物中的应用。
[0018] 所述的应用，为将含有上述根特异性表达启动子和抗虫基因的表达载体转入植物 中，使其在种子或根尖表达该抗虫基因，W防治地下害虫。
[0019] 本发明克隆了一个花生赤霉素氧化酶（Gibberellin 20 oxidase)基因上游 2inbp的启动子序列，将初步命名为AhOda启动子。含有15个ROOTMOTIFTAPOXl元件，I个与 OSElROOTNOmJLE元件，2个0SE2R00TN0DULE元件，S者都是与根特异表达相关的顺式作用元 件;构建了 3个5 '端系列缺失的植物表达载体，并转化烟草，对抗性苗进行GUS染色，结果显 示，转pAhOdais日日、pAhOda日18载体的烟草根部均被染成蓝色，而叶片无蓝色斑点，证明AhOda 启动子为根特异表达载体启动子，其最小核屯、区518bp的启动子片段仍能指导报告基因在 根部的特异表达。S个启动子的核巧酸序列见SEQ ID NO: USEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3所 /J、- O
[0020] 通过基因工程手段将本发明的根特异表达的启动子与抗病/抗虫基因相连，使抗 病/抗虫基因在根部定时、高效表达，达到防治病虫害的目的，为农民提供更多的生态安全 和安全管理策略的机会。通过上述报告基因转入及在根部的特异表达结果说明，可W构建 含有本发明的根特异表达启动子的表达载体，再插入对地下害虫高毒力的杀虫基因，转入 植株，使该杀虫基因在根部特异表达，W防治地下害虫，特别是对蛇蜡有高毒力cry8类基 因，采用转基因技术，转入花生植株，使其在根部表达，防治蛇蜡。
【附图说明】
[0021] 图1 contig288638上游序列的PCR扩增结果
[0022] 图2 AhOda启动子的生物信息学分析
[0023] 图3 AhOda根特异启动子各截短示意图
[0024] 图4 AhOda基因5'-race PCR结果
[0025] 1:01^20001曰浊6。1:411〇(13 5'-1?4〔6的？0?结果
[0026] 图5根特异启动子植物表达载体构建流程图
[0027] 图6植物表达载体pAhOdais日日（左图）、pAh0daii68(中）、pAh0da日18(右图）的载体构建 图
[002引 1:各截短PCR片段;2:负对照;3:相应的植物载体的双酶切化ind III+BamH 1);4: p2300GUSplus化ind III+BamH 1);5:相应的复制型载体的双酶切化ind III+BamH DM2000；M2:DMl5000
[0029] 图7 pAhOdais日日（1-2)、pAh0daii68(3-4)、pAh0da日 18(5-6)转化农杆菌LBA4404PCR鉴 定结果M: EOOOOMarker; CK:相应负对照；1、2: pAhOdais日日转化农杆菌的PCR扩增结果；3、4: pAh0daii68转化农杆菌的PCR扩增结果;5