甘蓝型油菜温敏型显性细胞核不育基因BnaAtsMs的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及油菜育种技术领域，尤其设及一种甘蓝型油菜溫敏型显性细胞核不育 基因化aAtsMs;具体地说，设及一个油菜溫敏型显性细胞核雄性不育基因化aAtsMs的分离 克隆、功能验证和应用，可W加快油菜等作物细胞核雄性不育两系法的选育，从而在繁殖制 种时获得100%不育的群体。
【背景技术】
[0002] 雄性不育可W分为细胞质雄性不育(CMS)和细胞核雄性不育(GMS)。细胞质雄性不 育为人类所知已有100多年的历史，并且在水稻、玉米和油菜等作物中广泛地用于生产杂交 种。油菜杂种优势利用是解决油菜产业目前面临问题的有效途径之一。杂种优势利用的关 键问题是如何W经济有效的方法实现杂交亲本雌雄配子发生融合、形成杂交种的同时，并 阻止杂交亲本自花授粉。目前，世界上可W用于油菜杂种优势利用的CMS系统有ogu、kos、 tour和波里马。其中，波里马CMS是目前国际上公认的最有实用价值的CMS系统W，但是波里 马不育系育性受到溫度的影响表现不稳定，制种风险较大，其应用受到了一定的限制。
[0003] 而细胞核雄性不育系统不育性稳定彻底，不存在不育胞质负效应和胞质单一化的 潜在风险，一般不受恢保关系的限制，很容易获得强优势组合，在杂种优势利用中具有广阔 的前景W。但是，目前油菜细胞核雄性不育系统在油菜杂种优势利用中的主要困难是，在制 种过程中不育系存在50%的可育株必须人工拔除，由此不仅增加了制种的成本，而且往往 由于可育株清除不彻底，影响制种纯度，增加了生产的风险。而W水稻光敏核不育"农星 58S"大规模应用为标志，光、溫敏细胞核雄性不育作为作物杂种优势利用的有效途径之一 已得到广泛应用。如果油菜杂种优势利用也能按照水稻育种系法^两系法"W的趋势发 展，将成为培育优质超高产杂交油菜品种、打破我国油菜杂种优势利用瓶颈的有效途径。
[0004] 目前，国内已报道了大量甘蓝型油菜光、溫敏细胞核雄性不育材料:溫敏核不育湘 91S(4)、Huiyou50S (5-6);光溫敏核不育系册05(7)、501-85(8)、化965 (9);环境敏感核不育系3735 光敏型核不育HY50SUU。并已经利用光溫敏细胞质雄性不育系501-8S成功选育出国内 第一个应用于生产上的生态型雄性不育两系杂交油菜组合"两优586" W，利用湘91S选育的 两系杂交种湘杂油5号和湘杂油7号已通过品种审定，表明两系杂交油菜在实际生产应用中 具有广阔前景。但是，甘蓝型油菜光、溫敏型细胞核雄性不育的基础研究严重滞后，有关甘 蓝型油菜光、溫敏型细胞核雄性不育基因的克隆和调控机理的研究尚属空白。而化aAtsMs 基因的克隆为甘蓝型油菜溫敏型细胞核雄性不育系在甘蓝型油菜杂种优势利用中的应用 提供理论基础。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于提供甘蓝型油菜溫敏型显性细胞核不育基因化aAtsMs，具体地 是克隆一个甘蓝型油菜溫敏型显性细胞核不育基因化aAtsMs，利用该基因使其保持系败 育，或作为新的核不育系和保持系选育的分子标记，W加快甘蓝型油菜核不育系和保持系 的选育。
[0006] 本发明的目的是运样实现的：
[0007] 一、甘蓝型油菜溫敏型显性细胞核不育基因化aAtsMs
[000引其核巧酸序列如序列表SEQ ID NO: 1所示;其氨基酸序列如序列表SEQ ID NO:2所 /J、- O
[0009] 二、甘蓝型油菜溫敏型显性细胞核不育基因化aAtsMs的获得方法
[0010] 通过分离和克隆技术，从甘蓝型油菜中分离得到；
[0011 ]采用PCR(polymerase chain reaction)技术，从基因组、mRNA和cDNA中扩增得到 本发明的基因W及任何感兴趣的一段多核巧酸或与其同源的一段多核巧酸。
[001^ 立、甘蓝型油菜溫敏型显性细胞核不育基因化aAtsMs的应用
[0013] ①用于甘蓝型油菜溫敏型显性核不育系的选育；
[0014] ②用于甘蓝型油菜溫敏型显性核不育系、保持系和恢复系的分子标记辅助选育。
[0015] 本发明具有下列优点和积极效果：
[0016] ①利用化aAtsMs基因序列结合基因工程技术可开发出油菜智能不育系统；
[0017] ②利用化aAtsMs基因序列信息可W实现分子标记辅助选择育种；
[0018] ③可实现油菜及相关作物两系杂交制种。
【附图说明】
[0019] 图1是覆盖甘蓝型油菜溫敏型显性细胞核不育基因化aAtsMs区段的物理图谱，图 中：
[0020] 虚线楠圆表示定位的化aAtsMs基因区段标记相对应的拟南芥同源性基因，
[0021] 虚线圆表示定位的化aAtsMs基因区段候选基因相对应的白菜同源性基因，
[0022] 浅色字表示预测的甘蓝型油菜溫敏型显性细胞核不育基因化aAtsMs的候选基因。
[0023] 图2是甘蓝型油菜功能互补测验表达载体pC2300-BnaAtsMs的构建图。
[0024] 图3是具有TE5遗传背景的To代遗传转化甘蓝型油菜植株开花后育性表型与TE5表 型的比较图；
[0025] TE5遗传转化To代植株携带显性基因化aAtsMs的候选基因，表现为花丝退化，育性 败育，KI染色无正常花粉。
[0026] 图4是甘蓝型油菜溫敏细胞核显性不育系TE5A半薄和超薄切片显微解剖结构图， 图中：
[0027] a、b、c、g、h和i分别是正常花药花粉母细胞时期、四分体时期、单核早期、单核靠边 期和成熟期半薄切片显微照片;d、e、f、j、k和1分别是不育花药对应时期的半薄切片显微照 片;E:外表皮;EN:中层;Md:内表皮;MC:小抱子母细胞;T:绒拉层;MMC:花粉母细胞;PCW:脱 服质壁;Tds:四分体;Msp:小抱子;PG:成熟花粉粒。
[0028] 图5是甘蓝型油菜溫敏细胞核显性不育系TE5A超薄切片显微解剖结构图，图中：
[0029] e、f、g和h分别是正常花药四分体时期、小抱子时期、小抱子、成熟花粉时期细胞结 构;a、b、C和d分别是不育花药对应时期的细胞结构;T:绒拉层细胞;MMC:花粉母细胞;MC:小 抱子母细胞;PG:成熟花粉粒。
[0030] 图6是甘蓝型油菜溫敏细胞核显性不育系TE5A脱服质观察图，图中：
[0031] e、f和g分别是正常花药花粉母细胞时期、四分体时期和单核期用苯胺蓝染色后观 察脱服质巧光的显微照片;a、b、c分别是不育花药对应时期的脱服质巧光的显微照片；d是 不育花药成熟花粉粒时期用苯胺蓝染色后观察脱服质巧光的显微照片。
【具体实施方式】
[0032] W下结合附图和实施例详细说明。应理解，运些实施例仅用于说明本发明而不用 于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如《分 子克隆：实验室指南》（化W York = Cold Spring化rbor LaboratoiT,1989)中所述的条件， 或者按照生产厂商提供的操作手册中建议的条件。
[0033] -、实施例1:甘蓝型油菜溫敏细胞核显性不育材料遗传规律分析
[0034] 1、实验材料
[0035] 本实验所用的材料为甘蓝型油菜溫敏细胞核显性两型系TE5ABW>，其中不育株称 为TE5A，可育株称为TE5B。甘蓝型油菜溫敏细胞核显性两型系TE5AB材料来源:在甘蓝型油 菜自交系TE5中获得2株不育单株，将不育单株与甘蓝型油菜自交系TEl杂交，杂交一代Fi自 交获得杂交二代F2,并用TEl作为轮回亲本回交获得近等基因系。
[0036] 2、溫敏细胞核显性不育材料遗传规律
[0037] 采用经典遗传学方法，对溫敏型不育材料TE5A与育性正常甘蓝型油菜TEl的正反 杂交Fi、F2和回交分离群体进行分析。测验结果表明（表1):溫敏型不育材料TE5A的不育性状 受一对显性细胞核基因控制，无细胞质效应。
[0038] 表1溫敏型显性细胞核雄性不育系TE5A遗传分析
[0039]
[0040] 二、实施例2:构建含甘蓝型油菜溫敏型显性细胞核不育基因化aAtsMs区段的遗传 图谱
[0041 ] 1、实验材料
[0042] 溫敏显性细胞核不育基因的定位群体TE5AB是由其对应的亲本TEl连续回交后构 建的近等基因系群体^>。2012年春播种于西宁，2012年夏天提取700个来源于TE5AB近等基 因系的不育单株的DNA^l，用于基因的精细定位。
[0043] 2、精细定位甘蓝型油菜溫敏型显性细胞核不育基因化aAtsMs
[0044] 根据初步定位的结果该基因位于油菜N 0 8连锁群的S C A R ( S e q U e n C e characterized amplified region)标记SC巧日SCl