一种als突变型基因在抗除草剂方面的应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于植物蛋白和植物抗除草剂领域。具体而言，本发明设及水稻的乙酷乳 酸合成酶(ALS)突变蛋白，该蛋白能赋予植物尤其水稻抗乙酷乳酸合成酶抑制剂类除草剂 的特性。本发明公开了该蛋白的序列，W及它们在植物抗除草剂领域中的应用。
【背景技术】
[0002] 杂草是制约农业生产稳产高产的不利因素。与传统依靠栽培措施、人工除草和机 械除草等方法相比，化学除草剂的使用是一种高效的、简便的和经济的治理杂草方法。
[0003] 乙酷乳酸合成酶(ALS)(也称乙酷径酸合成酶，AHAS;EC 4.1.3.18)抑制剂类除草 剂WALS作为祀标而导致杂草死亡，主要包括横酷脈类（Sulfonylureas，SU)、咪挫嘟酬类 (Imidazolinones , IMI )、S挫喀晚类（TriazoIopyrimidines ,TP)、喀晚氧（硫）苯甲酸类 [PyrimidinyIthio(or oxy)-benzo曰tes,PTB;pyrimidinyl-c曰rboxyherbicides;PCs]和横 酷胺基幾基S挫嘟酬类（Sulfonylamino-ca;rbonパ1:;riazolinones,SCT)等l3类化合物。ALS 抑制剂类除草剂具有选择性强、杀草谱广、低毒高效等特点，目前已大面积推广使用。但运 些除草剂对一般不具有抗(耐)除草剂特性的农作物本身也产生药害，极大限制了其使用时 间和使用空间，如需要在农作物播种前一段时间使用除草剂才能避免农作物遭受药害。培 育抗(耐)除草剂作物品种可减少作物药害、拓宽除草剂的使用范围。
[0004] 成熟的ALS蛋白大约由670个氨基酸组成，其序列在不同物种间高度保守。ALS蛋白 在Gly 95、Ala 96、Ala 122、Pro 171、Pro 196、Pro 197、Ala 205、Asp 376、T巧 537、T巧 548、Trp 552、Trp 557、Trp 563、Trp 574、Ser 621、Ser 627、Ser 638、Ser 653、Gly 654、 化I 669等氨基酸位点（W模式植物拟南芥的ALS氨基酸位置计算)发生突变可W产生ALS抑 制剂类除草剂抗性，运在多种农作物(包括玉米、小麦、水稻、油菜、向日葵等）、模式植物拟 南芥和上百种杂草中均有报道。
[0005] 其中，水稻已知的抗ALS抑制剂突变位点包括Gly 95、Ala 96、Ala 122、lYp 548、 Ser 627、Ser 653和Gly 654eALS突变体抗除草剂水平与ALS氨基酸突变的位置有关，还与 突变后的氨基酸种类及突变氨基酸的数目有关。
[0006] 目前，ALS抑制剂类除草剂的作用机理尚未确定，很难提前预测ALS蛋白其它氨基 酸位点的突变是否会产生除草剂抗性，只能依赖于科研人员长期、艰苦的实践探索，并凭 借一些运气才可能发现ALS蛋白新的除草剂抗性位点。
【发明内容】
[0007] 本发明所要解决的第一个技术问题是提供一种ALS突变型基因。
[000引本发明还要解决的技术问题是提供上述ALS突变型基因所编码的ALS蛋白。
[0009] 本发明还要解决的技术问题是提供了含有上述的ALS突变型基因的表达盒、重组 载体或细胞。
[0010] 本发明还要解决的技术问题是提供了上述ALS突变型基因、蛋白、表达盒、重组载 体或细胞在制备绿色植物除草剂方面的应用。
[0011] 本发明还要解决的技术问题是提供了获得具有除草剂抗性的绿色植物的方法。
[0012] 本发明最后要解决的技术问题是提供了鉴定具有除草剂抗性的绿色植物的方法。
[0013] 本发明人通过长期、艰苦的研究，对釉稻优良恢复系9311的EMS突变植株进行长 期、不断地筛选，发现了一系列ALS突变蛋白，包括前文所述的某些已知ALS突变蛋白和新 ALS突变蛋白，其对ALS抑制剂类除草剂不敏感，从而使得植物具有ALS抑制剂类除草剂抗 性。本发明在植物育种中的应用，可用于培育具有除草剂抗性的植物，尤其是农作物，还开 发了运些蛋白及其编码基因在转基因或者非转基因如水稻等作物中的应用。
[0014] 为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：一种ALS突变型基因，其在水 稻的ALS基因序列的第75位核巧酸由G变成核巧酸C、第339位核巧酸由A变成核巧酸C和第 710位核巧酸由C突变为核巧酸T。
[001引上述ALS突变型基因其核巧酸序列如沈Q ID No:3所示。
[0016] 上述的ALS突变型基因所编码的ALS蛋白。该突变来源于水稻，与对ALS抑制剂类除 草剂敏感的野生型水稻ALS(如Genbank登录号BAB20812.1)相比，其氨基酸在Gln25、 Glnll3、Ala237(突变植株2)位点上发生突变;或其在水稻的ALS基因序列的第75位核巧酸 由G变成核巧酸C、第339位核巧酸由A变成核巧酸C，该ALS突变型基因其核巧酸序列如SEQ ID No:l所示，即其氨基酸在Gln25、Glnll3(突变植株1)位点上发生突变(其氨基酸序列如 沈Q ID NO.2所示）。
[0017] 目前还没有报道表明，在来自水稻的ALS的Gln25、Glnl 13和Ala237位点突变，会使 得水稻具有ALS抑制剂类除草剂抗性。
[0018] 上述的ALS蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。
[0019]本
【发明内容】
还包括表达盒、重组载体或细胞，其含有上述的AL狭变型基因。
[0020] 本
【发明内容】
还包括上述的ALS突变型基因、蛋白、表达盒、重组载体或细胞在绿色 植物抗除草剂方面的应用。
[0021] 上述绿色植物为水稻、烟草、拟南芥、棉花等。
[0022] 本
【发明内容】
还包括获得具有除草剂抗性的绿色植物的方法，包括如下步骤：
[0023] 1)使绿色植物包含所述的ALS突变型基因；或
[0024] 2)使绿色植物表达所述的ALS蛋白。
[0025] 上述的方法，包括转基因、杂交、回交或无性繁殖步骤。
[0026] 鉴定权利要求上述的方法获得的绿色植物的方法，包括W下步骤：
[0027] 1)测定所述绿色植物是否包含上述的ALS突变型基因；或，
[002引 2)测定所述绿色植物是否表达上述的ALS蛋白。
[0029] 有益效果：田间喷施ALS抑制剂类除草剂"百垄通"的实验结果表明，含有本发明的 ALS突变蛋白的水稻3-4叶幼苗在施用3mL百垄通/L水(9倍推荐使用浓度)后，植株仍然正常 生长发育和结实，而野生型水稻3-4叶幼苗在施用ImL百垄通/化水（1倍推荐使用浓度)30天 后表现为整株死亡。
【附图说明】
[0030] 图1百垄通除草剂筛选获得的抗性水稻突变体；
[00川图2 PCR扩增ALS基因5'端结果图；第I泳道为Marker;Marker分子量从上到下依次 为化6、3此、化6、1此、75化9、50069、25化9、10化9，第2泳道为9311野生型水稻0臟，第3~13 泳道为抗除草剂突变植株1的DNA，其它泳道为抗除草剂突变植株2的DNA;目的片段长度 1162bp；
[0032] 图3 PCR扩增ALS基因3'端结果图；第1泳道为MarkenMarker分子量从上到下依次 为化6、3此、化6、1此、75化9、50069、25化9、10化9，第2泳道为9311野生型水稻0臟，第3~13 泳道为抗除草剂突变植株1的DNA，其它泳道为抗除草剂突变植株2的DNA;目的片段长度 120 化P;
[0033] 图4A和图4B分别为百垄通除草剂对野生型和抗除草剂突变植株1和突变植株2的 ALS酶活性抑制；
[0034] 图5百垄通除草剂对野生型和抗除草剂水稻突变体突变植株1和突变植株2的ALS 酶活性抑制的吸光值测定；
[0035] 图6A和图6B分别为甲喀横隆除草剂对野生型和抗除草剂水稻突变体突变植株1和 突变植株2的ALS酶活性抑制；
[0036] 图7甲喀横隆除草剂对野生型和抗除草剂水稻突变体突变植株1和突变植株2的 ALS酶活性抑制的吸光值测定。
[0037] 图8A突变突变植株1的ALS基因的过量表达载体BamHI/SacI双酶切验证图；第1泳 道为Marker !Marker分子量从上到下依次为 19329、7743、6223、4254、3472、2690、1882、 1489、92化P，第2泳道为未经酶切的重组载体，第3泳道为重组载体经BamHI/SacI双酶切后 产生的基因片段和质粒片段DNA;图8B突变突变植株2的ALS基因的过量表达载体BamHI/ SacI双酶切验证图；第1泳道为未经酶切的重组载体，第2泳道为Marker，分子量从上到下依 次为化b、3kb、、化b、750bp、500bp、250bp、IOObp，第3、4泳道为重组载体经BamHI/SacI 双 酶切后产生的基因片段和质粒片段DNA，基因片段大小符合预期，证明载体构建成功；
[0038] 图9转突变型ALS基因水稻PCR检测图；总共有21个泳道，第1泳道、第9泳道、第19泳 道为Marker; Marker 分子量从上到下依次为f5kb、3kb、化b、1 kb、750bp、500bp、250bp、1 OObp， 第8泳道、第18泳道为为野生型DNA，作为阴性对照，第20、21泳道为质粒DNA，作为阳性对照， 第3~7泳道为突变植株1的转基因DNA，其他泳道为突变植株2的转基因DNA。
【具体实施方式】
[00