一种细菌多糖修饰的重组融合蛋白的制备方法及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明设及一种多糖修饰蛋白的制备方法及其应用；特别设及一种细菌多糖修饰 的重组融合蛋白的制备方法及其应用，属于生物医药领域。
【背景技术】
[0002] 病原菌的0多糖（OP巧、芙膜多糖（CP巧等往往是其重要的保护性抗原，如大肠杆 菌的0157型0PS，霍乱弧菌的Ol型、0139型0PS，肺炎链球菌的4型、6B型、9V型、14型、 18C型、19F型、23F型CPS等，金黄色葡萄球菌的CP5型和CP8型CPS，等等。许多针对多糖 的抗体为病原菌的中和抗体，因此多糖疫苗的研发一直是细菌疫苗研发的重点之一。
[0003] 肺炎多糖疫苗、脑膜炎多糖疫苗、流感嗜血杆菌多糖疫苗、伤寒Vi多糖疫苗等一 批多糖疫苗已经上市多年。但多糖疫苗的免疫记忆和免疫原性较弱，特别是在2岁W下儿 童和老年人体内尤为突出。现在运类疫苗的研发重点已转向多糖-蛋白结合疫苗，其中7 价肺炎多糖-蛋白结合疫苗、4价脑膜炎结合疫苗、b型流感嗜血杆菌结合疫苗已经上市， 一批多糖-蛋白结合疫苗正处于不同的研发阶段。但是，多糖-蛋白结合疫苗采用化学法 制备，包括W下步骤：①大规模培养病原菌（或其疫苗株），从中提取多糖；②制备并提纯白 喉、破伤风等毒素蛋白，灭活后作为载体蛋白；③通过化学方法交联多糖和载体蛋白；④再 次纯化交联的多糖-蛋白结合物制备疫苗。该过程存在W下问题：①大规模培养病原菌弱 毒的疫苗株提取多糖存在一定安全风险，有时需要负压厂房，而对烈性病原体，往往只有在 获得病原菌的减毒株后，才能通过大规模培养提取多糖；②通过化学方法提取的多糖为混 合物，纯度较低，质控困难，易引起副反应；③多糖与载体蛋白交联为随机过程，产物均一性 差，纯化和质量控制困难；④生产过程步骤多，得率低，成本高。
[0004] 近些年来，随着测序技术和生物信息学的发展，在多种细菌中发现了天然的蛋白 质糖基化修饰系统，如空肠弯曲弧菌的N-糖基化修饰系统、奈瑟球菌和绿脈杆菌的0-糖基 化修饰系统，运些糖基化修饰系统中，多糖的合成途径与细菌的脂多糖和芙膜多糖的合成 途径十分相似，多糖结构取决于糖基合成基因簇，而其寡糖转移酶对其转移的多糖专一性 较低。其中空肠弯曲弧菌N-糖基化修饰系统中的寡糖转移酶PglB对多糖底物的要求为多 糖还原末端第一位糖基的C2位必须有乙酷氨基，且第二位糖基不能W 0 (1-4)糖巧键与其 连接。而脑膜炎奈瑟球菌0-糖基化修饰系统中的寡糖转移酶PglL对多糖底物无类似的要 求，PglL能将还原末端第一位糖基C2位无乙酷氨基的多糖转移至蛋白的糖基化位点上，因 此具有更广泛的应用前景。但目前关于PglL对蛋白底物特异性的研究较少，目前其已知的 底物仅为奈瑟球菌菌毛蛋白PilE,运限制了其用于多糖修饰蛋白疫苗的制备。
【发明内容】
阳0化]本发明的目的是提供一种细菌多糖修饰的重组融合蛋白的制备方法及其应用。
[0006] 本发明提供一种细菌多糖修饰的重组融合蛋白的制备方法，是将重组融合蛋白和 脑膜炎奈瑟球菌0-寡糖转移酶PglL在0-抗原连接酶基因缺陷的细菌中共表达，脑膜炎奈 瑟球菌O-寡糖转移酶PglL将细菌自身的多糖或外源多糖连接到重组融合蛋白上，得到细 菌多糖修饰的重组融合蛋白；
[0007] 所述重组融合蛋白含有N端信号肤、具有脑膜炎奈瑟球菌0-寡糖转移酶PglL的 糖基化位点的肤段和载体蛋白序列；
[0008] 所述载体蛋白为细菌毒素蛋白的无毒突变体或细菌毒素蛋白的部分片段；
[0009] 所述具有脑膜炎奈瑟球菌0-寡糖转移酶PglL的糖基化位点的肤段位于所述载体 蛋白序列的N端或C端；
[0010] 所述脑膜炎奈瑟球菌0-寡糖转移酶PglL的氨基酸序列如SEQ ID No. 26所示，或 其具有类似功能的突变体；
[0011] 所述细菌多糖修饰的重组融合蛋白为细菌自身的多糖修饰的重组融合蛋白或外 源多糖修饰的重组融合蛋白； 阳01引所述0-抗原连接酶基因缺陷使得0抗原多糖不能连接到类脂A-核屯屬糖上，从 而不能形成脂多糖。
[0013] 上述方法中，所述信号肤可 W是化 1B、DsbA、ST II、OmpA、I%oA、LamB、SpA、Enx 等 信号肤，本发明采用的是化bA信号肤，其氨基酸序列如SEQ ID No. 32中自N端起第I位至 第19位所示；
[0014] 所述脑膜炎奈瑟球菌0-寡糖转移酶PglL的糖基化位点为脑膜炎奈瑟球菌菌毛蛋 白Pi化的自N端起第63位的丝氨酸；
[0015] 所述具有脑膜炎奈瑟球菌0-寡糖转移酶PglL的糖基化位点的肤段为含有脑膜炎 奈瑟球菌菌毛蛋白Pi化的自N端起第63位丝氨酸的脑膜炎奈瑟球菌菌毛蛋白Pi化的肤 段，具体为至少含有脑膜炎奈瑟球菌菌毛蛋白Pi化的自N端起第55至第66位氨基酸的任 意肤段，更具体为如下任一所示：
[0016] (1) SEQ ID No. 32中自N端起第128位至第156位氨基酸所示的肤段或其串联重 复序列；
[0017] (2)SEQ ID No. 34中自N端起第128位至第154位氨基酸所示的肤段或其串联重 复序列；
[0018] (3) SEQ ID No. 36中自N端起第128位至第152位氨基酸所示的肤段或其串联重 复序列；
[0019] (4) SEQ ID No. 38中自N端起第128位至第150位氨基酸所示的肤段或其串联重 复序列；
[0020] (5) SEQ ID No. 40中自N端起第128位至第149位氨基酸所示的肤段或其串联重 复序列；
[0021] (6)SEQ ID No. 48中自N端起第22位至第40位氨基酸所示的肤段或其串联重复 序列；
[0022] (7) SEQ ID No. 50中自N端起第22位至第36位氨基酸所示的肤段或其串联重复 序列；
[0023] (8) SEQ ID No. 52中自N端起第22位至第33位氨基酸所示的肤段或其串联重复 序列。
[0024] 上述任一所述的方法中，所述细菌毒素蛋白的无毒突变体为绿脈杆菌外毒素蛋白 A无毒突变体；
[00巧]所述细菌毒素蛋白的部分片段为霍乱毒素B亚单位或破伤风毒素C蛋白； 阳0%] 所述绿脈杆菌外毒素 A无毒突变体的氨基酸序列如SEQ ID No. 46中自N端起第 20位至第631位所示；
[0027] 所述霍乱毒素 B亚单位的氨基酸序列如SEQ ID No. 32中自N端起第20位至第 122位所示；
[0028] 所述破伤风毒素 C蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No. 60中自N端起第20位至第 455位所示。
[0029] 上述任一所述的方法中，所述重组融合蛋白的氨基酸序列为如下任一所示：
[0030] (1)沈Q ID No. 32所示的氨基酸序列；
[0031] (2)沈Q ID No. 34所示的氨基酸序列；
[0032] (3)沈Q ID No. 36所示的氨基酸序列；
[0033] (4)沈Q ID No. 38所示的氨基酸序列；
[0034] (5)沈Q ID No. 40所示的氨基酸序列；
[0035] (6)沈Q ID No. 46所示的氨基酸序列；
[0036] (7)沈Q ID No. 48所示的氨基酸序列；
[0037] (8)沈Q ID No. 50所示的氨基酸序列；
[0038] (9)沈Q ID No. 52所示的氨基酸序列；
[0039] (10)沈Q ID No. 56所示的氨基酸序列； W40] (11)沈Q ID No. 58所示的氨基酸序列；
[0041] (12)沈Q ID No. 60所示的氨基酸序列。
[0042] 上述任一所述的方法中，所述重组融合蛋白是通过重组表达载体导入所述细菌中 的，所述重组表达载体是将所述重组融合蛋白的编码基因插入PMMB66邸的多克隆位点间 得到的；
[0043] 所述重组融合蛋白的编码基因如下：
[0044] (1)所述重组融合蛋白为SEQ ID No. 32所示的氨基酸序列时，其编码基因如SEQ ID No. 31 所示；
[0045] (2)所述重组融合蛋白为SEQ ID No. 34所示的氨基酸序列时，其编码基因如SEQ ID No. 33 所示；
[0046] (3)所述重组融合蛋白为SEQ ID No. 36所示的氨基酸序列时，其编码基因如SEQ ID No. 35 所示；
[0047] (4)所述重组融合蛋白为SEQ ID No. 38所示的氨基酸序列时，其编码基因如SEQ ID No. 37 所示；
[0048] (5)所述重组融合蛋白为SEQ ID No. 40所示的氨基酸序列时，其编码基因如SEQ ID No. 39 所示；
[0049] (6)所述重组融合蛋白为SEQ ID No. 46所示的氨基酸序列时，其编码基因如SEQ ID No. 45 所示；
[0050] (7)所述重组融合蛋白为SEQ ID No. 48所示的氨基酸序列时，其编码基因如SEQ ID No. 47 所示；
[0051] (8)所述重组融合蛋白为SEQ ID No. 50所示的氨基酸序列时，其编码基因如SEQ ID No. 49 所示；
[0052] (9)所述重组融合蛋白为SEQ ID No. 52所示的氨基酸序列时，其编码基因如SEQ ID No. 51 所示；
[0053] (10)所述重组融合蛋白为SEQ ID No. 56所示的氨基酸序列时，其编码基因如SEQ ID No. 55 所示；
[0054] (11)所述重组融合蛋白为SEQ ID No. 58所示的氨基酸序列时，其编码基因如SEQ ID No. 57 所示； 阳化5] (12)所述重组融合蛋白为SEQ ID No. 60所示的氨基酸序列时，其编码基因如SEQ ID No. 59 所示；
[0056] 所述多克隆位点为EcoR I和化nd III位点；
[0057] 所述脑膜炎奈瑟球菌0-寡糖转移酶PglL是通过重组表达载体导入所述细菌 中的，所述重组表达载体是将所述脑膜炎奈瑟球菌0-寡糖转移酶PglL的表达盒插入 pET28a(+)的多克隆位点间得到的；
[0058] 所述脑膜炎奈瑟球菌0-寡糖转移酶PglL的表达盒如SEQ ID No. 30所示；
[0059] 所述多克隆位点为Bgl II位点。
[0060] 上述任一所述的方法中，所述外源多糖是通过含有多糖合成基因簇的重组表达载 体导入所述细菌的；
[0061] 所述多糖合成基因簇如SEQ ID No. 79所示；
[0062] 所述含有多糖合成基因簇的重组表达载体按照如下方法制备：Asc I与Not I双 酶切沈Q ID No. 79所示的DNA分子，得到基因片段；Asc I与Not I双酶切沈Q ID No. 82 所示的DNA分子，得到载体大片段；将基因片段与载体大片段连接，即得。
[0063] 上述任一所述的方法中，所述0-抗原连接酶基因缺陷的细菌为0-抗原连接酶基 因缺陷的福氏志贺氏菌、0-抗原连接酶基因缺陷的甲型副伤寒沙口氏菌或0-抗原连接酶 基因缺陷的大肠杆菌；
[0064] 所述0-抗原连接酶基因缺陷的大肠杆菌具体为大肠杆菌K12系列菌株； 阳0化]上述任一所述的方法中，所述细菌为福氏志贺氏菌时，所述将重组融合蛋白和脑 膜炎奈瑟球菌0-寡糖转移酶PglL在0-抗原连接酶基因缺陷的细菌中共表达的方法为将 含有所述重组融合蛋白的表达载体和所述脑膜炎奈瑟球菌0-寡糖转移酶PglL的表达载体 导入0-抗原连接酶基因缺陷的福氏志贺氏菌中进行诱导表达；
[0066] 所述福氏志贺氏菌为毒力大质粒缺失的福氏志贺氏菌；
[0067] 所述毒力大质粒缺失的的福氏志贺氏菌的制备方法具体为：将地Dinc导入所述 福氏志贺氏菌中，利用不相容原理进行所述毒力大质粒的缺失，再利用地Dinc的溫度敏感 特性将pKDinc去除； W側所述0-抗原连接酶基因为waal基因；
[0069] 所述细菌多糖修饰的重组融合蛋白为脑膜炎奈瑟球菌0-寡糖转移酶PglL将福氏 志贺氏菌自身的0-多糖连接到重组融合蛋白上，得到细菌多糖修饰的重组融合蛋白。
[0070] 上述任一所述的方法中，所述细菌为甲型副伤寒沙口氏菌时，所述将重组融合蛋 白和脑膜炎奈瑟球菌0-寡糖转移酶PglL在0-抗原连接酶基因缺陷的细菌中共表达的方 法为将含有所述重组融合蛋白的表达载体和所述脑膜炎奈瑟球菌O-寡糖转移酶PglL的表 达载体导入0-抗原连接酶基因缺陷的甲型副伤寒沙口氏菌中进行诱导表达； W71] 所述0-抗原连接酶基因为WaaL基因；
[0072] 所述细菌多糖修饰的重组融合蛋白为脑膜炎奈瑟球菌0-寡糖转移酶PglL将甲型 副伤寒沙口氏菌自身的0-多糖连接到重组融合蛋白上，得到细菌多糖修饰的重组融合蛋 白。
[0073] 上述任一所述的方法中，所述细菌为大肠杆菌K12系列菌株时，所述将重组融合 蛋白和脑膜炎奈瑟球菌0-寡糖转移酶PglL在0-抗原连接酶基因缺陷的细菌中共表达的 方法为将含有所述重组融合蛋白的表达载体、所述脑膜炎奈瑟球菌0-寡糖转移酶PglL的 表达载体、含有多糖合成基因簇片段的表达载体导入0-抗原连接酶基因缺陷的大肠杆菌 K12系列菌株中进行诱导表达； W74] 所述0-抗原连接酶基因为WaaL基因；
[00巧]所述大肠杆菌K12系列菌株0抗原合成途径中的关键糖基转移酶鼠李糖转移酶基 因Wb化天然插入失活，不能合成自身0抗原；
[0076] 所述细菌多糖修饰的重组融合蛋白为脑膜炎奈瑟球菌0-寡糖转移酶PglL将外源 多糖连接到重组融合蛋白上，得到细菌多糖修饰的重组融合蛋白；
[0077] 所述外源多糖是通过将含有多糖合成基因簇片段的表达载体导入所述大肠杆菌 K12系列菌株进行表达得到的；
[0078] 所述多糖合成基因簇如SEQ ID No. 79所示；
[0079] 所述含有多糖合成基因簇片段的表达载体按照如下方法制备：Asc I与Not I双 酶切沈Q ID No. 79所示的DNA分子，得到基因片段；Asc I与Not I双酶切沈Q ID No. 82 所示的DNA分子，得到载体大片段；将基因片段与载体大片段连接，即得。
[0080] 上述任一所述的方法中，所述表达之后还有细菌裂解、离屯、收集上清、除盐和/或 分离纯化的步骤；
[0081] 所述分离纯化为离子交换层析和/或分子筛层析。
[0082] 由上述任一所述的方法制备得到的细菌多糖修饰的重组融合蛋白也属于本发明 的保护范围；
[0083] 或，
[0084] 一种由上述任一所述的方法制备得到的细菌多糖修饰的重组融合蛋白制备的疫 苗也属于本发明的保护范围；
[00化]所述疫苗能引起动物体内产生抗0抗原多糖的特异性抗体；
[0086] 所述疫苗具体含有氨氧化侣佐剂。
[0087] 上述任一所述的方法制备得到的细菌多糖修饰的重组融合蛋白在制备能引起动 物体内产生抗0抗原多糖的的特异性抗体的产品中的应用也属于本发明的保护范围； W蝴或，
[0089] 上述任一所述的方法制备得到的细菌多糖修饰的重组融合蛋白在制备预防和或 治疗细菌引起的疾病的产品中的应用也属于本发明的保护范围；
[0090] 所述产品具体为疫苗；
[0091] 所述细菌具体为福氏志贺氏菌、甲型副伤寒沙口氏菌或大肠杆菌；
[0092] 所述疫苗具体含有氨氧化侣佐剂。
[0093] 本发明在0-抗原连接酶基因缺陷的宿主菌中，共表达脑膜炎奈瑟球菌0-寡糖转 移酶PglL基因、重组融合蛋白基因，或在0-抗原连接酶基因和0抗原合成基因双缺陷的宿 主菌中，共表达脑膜炎奈瑟球菌0-寡糖转移酶PglL基因、重组融合蛋白基因和外源细菌多 糖合成基因簇，获得了细菌多糖修饰的重组融合蛋白。
[0094] 与现有的化学交联制备多糖蛋白相比，采用本发明的方法制备的细菌多糖修饰的 重组融合蛋白具有多糖结合位点均一、质量易控等优点，并且通过工程菌培养直接制备得 到细菌多糖修饰的重组融合蛋白，不需要多糖制备、载体蛋白制备、化学交联等多个步骤， 具有生产高效，成本低、生物安全性好等优点。采用本发明的方法制备的细菌多糖修饰的重 组融合蛋白免疫小鼠，可获得抗细菌多糖的特异性抗体，将运种细菌多糖修饰的重组融合 蛋白用于细菌多糖蛋白结合疫苗的制备，可W避免病原菌培养的诸多问题，提高疫苗的均 一性W及生产效率，降低疫苗制备的成本。
[0095] 本发明对多糖修饰蛋白疫苗的制备具有广泛的应用前景。
【附图说明】
[0096] 图 1 为 S. flexneri 2a 301 A pCP 的 PCR 鉴定。
[0097] 图 2 为 S. f Iexneri 2a 301 A pCP A waal 的 PCR 鉴定。
[0098] 图3为S. fIexneri 2a 301 ApCPAwaaI的脂多糖合成缺陷银染验证。
[0099] 图4为脑膜炎奈瑟球菌菌毛蛋白Pi化的S级结构。
[0100] 图5为重组CTB融合蛋白糖基化情况的WB检测。
[0101] 图6为重组EPA融合蛋白糖基化情况的WB检测。 阳10引 图7为糖蛋白rCTB4573-0PSsf3Di纯化结果的SDS-PAGE和WB检测。 阳10引图8为糖蛋白巧PA4573-0PSsf3Di纯化结果的SDS-PAGE和WB检测。 阳104] 图9为糖蛋白的免疫原性评价。
[01化]图10为多糖基化位点的重组融合蛋白糖基化修饰的WB检测。
[0106] 图11为糖蛋白rTTC4573-〇PSsf3〇i的肥检测。
[0107] 图 12 为 S. paratyphi CMCC50973 A WaaL 的 PCR 鉴定。 阳1〇8] 图13为S. paratyphi CMCC50973 AwaaL的脂多糖合成缺陷银染验证。 阳109] 图14为糖蛋白巧PA4573-0PSspty日。973的WB检测。
[0110]图 IS 为糖蛋白 rCTB4573-OPSspty5〇973的肥检测。 阳1 川 图 16 为 E. COli W3110 AwaaL 的 PCR 鉴定。
[0112] 图 17 为糖蛋白 rCTB4573-〇PSEc〇i日7的 WB 检测。
【具体实施方式】
[0113] 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0114] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0115] P邸inc 重组质粒在文献"Global Analysis of a Plasmid-Qirred Siigella flexneri Strain:New Instghts into