BudAB基因过表达的产酸克雷伯氏菌基因工程菌株的构建方法及其发酵方法

文档序号:9919810阅读:884来源:国知局
BudAB基因过表达的产酸克雷伯氏菌基因工程菌株的构建方法及其发酵方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及一种BudAB基因过表达的基因工程菌株的构建方法及其发酵方法。
【背景技术】
[0002] 基因表达受到一个启动单位的控制,我们称之为启动子。启动子主要控制基因在 适当的时候进行适量的表达。在研究工作中,常采用过表达技术,用一个强启动子,让其过 量表达,从而研究基因的功能。
[0003] 目前困扰人们大规模生物法生产2,3-下二醇的原因主要还是产量,虽然人们不断 尝试使用发酵条件优化、菌种诱变育种、菌种代谢调控等手段,但是效果并不是特别明显。 我们在分析了2,3-下二醇代谢网络之后发现,在产酸克雷伯氏菌化Iebsiella O巧toca) HD79中屯、碳代谢产2,3-下二醇合成途径中,有S个关键酶起到了非常重要的作用,即a-乙 酷乳酸脱簇酶、a-乙酷乳酸合成酶和2,3-下二醇脱氨酶分别由BudA、BiulB和BudC基因编码 蛋白。如果通过对运=个关键酶进行过量表达,使更多的碳源流向2,3-下二醇代谢途径,为 今后基因过表达及2,3-下二醇的生产提供理论依据。

【发明内容】

[0004] 本发明是为了解决现有产酸克雷伯氏菌2,3-下二醇产量低的问题,提供一种产酸 克雷伯氏菌基因工程菌株的构建方法及其发酵方法,该基因工程菌株可高产2,3-下二醇。
[0005] 本发明BudAB基因过表达的产酸克雷伯氏菌基因工程菌株的构建方法,按W下步 骤进行:
[0006] 一、从产酸克雷伯氏菌皿79中分别扩增BudA基因和BudB基因,构建克隆载体 pMDl S-T-BudA 和 pMD18-T-Bu 地;
[0007] 二、W表达质粒pRSFDuet-1为骨架,向质粒上的多克隆位点插入目的基因biulB,构 建重组过表达质粒9315胖-扣地,^91?15胖-扣地为骨架,插入目的基因扣(^构建重组过表达 质粒 pRS 抑 uet-1-BudAB;
[000引 S、将重组过表达质粒pRSFDuet-1-BudAB电转化K.0巧toca HD79感受态细胞,即 得到重组菌株Klebsiella O巧toca皿79-budAB。
[0009] 上述方法构建的产酸克雷伯氏菌基因工程菌株的发酵方法,按W下步骤进行:
[0010] -、将重组菌株Klebsiella oxytoca皿79-budAB单菌落接种到种子培养基中,30 °C,150r/min培养至对数生长期,得种子液;
[0011] 二、然后将种子液W5%接种量接种到装液量为150mL/500mL发酵培养基中,底物 葡萄糖150g/L,于30 °C,150r/min发酵120h后结束。
[001^ 步骤一中所述种子液培养基配方:(NH4)2S04 lg/L、K2HP04.3H20 3.4g/L、 K也P041.3g/L、MgS04 0.2g/L、酵母提取物Ig/L、微量元素2mL/L和铁溶液ImL/L,其中铁溶液 浓度为5mg/mL,调pH值至7.0,12rC高压灭菌15min,之后向每IOOmL种子培养基中加入经 108°C高压灭菌20min的5g葡萄糖粉末。
[OOU] 步骤二中所述发酵培养基的配方为:(NH4)2S04 6.6g/L,K2册〇4*3出O 5.25g/L, K此P〇4 9.5g/L,MgS〇4 0.25g/L,酵母提取物5g/L,微量元素ImL/L,铁溶液ImL/L调pH值至 6.8,121°(:高压灭菌15111111;其中铁溶液浓度为5111肖/1111^。
[0014] 本发明的有益效果:
[0015] 本发明构建了含有BudAB基因过表达重组质粒,利用电转化方法转入感受态细胞 中,通过巧光定量PCR方法测定突变株BudAB基因的mRNA表达水平时发现,BudAB基因过表达 基因工程菌株均比原始菌株的基因表达量高;BudA、BiulB基因过表达量为原始菌株相关基 因表达量的39.43倍和51.25倍。利用SDS-PAGE检测过表达基因工程菌株相应基因蛋白的表 达时发现,分别在29kDa和60kDa处出现目的条带,并且两种蛋白的表达量均高于原始菌株。
[0016] 本发明构建的重组菌株Klebsiella O巧toca HD79-budAB的2,3-下二醇最高产量 可达33.3565g/L,比原始菌株提高了34.80%。重组菌株的ODsQQnm值要低于原始菌株,可见单 一的从OD值上并不能表明菌株产2,3-下二醇的能力;一般来说,当发酵液的pH值偏碱性时, 易产生有机酸;当pH值偏酸性时,有机酸产量会下降,同时2,3-下二醇的产量有所提高,所 W本发明的重组菌株产2,3-抓的能力要高于原始菌株。
[0017] 本发明关于基因过表达菌株的构建的研究为今后基因功能的研究和2,3-下二醇 生产提供理论了依据。
【附图说明】
[0018] 图1为budA基因PCR扩增产物电泳图;其中M为DNA Marker DL2000,泳道1和2为 budA基因PCR产物;
[0019] 图2为budB基因PCR扩增产物电泳图;其中M为DNA Marker DL2000,泳道1和2为 bu地基因PCR产物;
[0020] 图3为budA基因阳性克隆菌液PCR验证结果;其中M为DNA Marker DL2000;泳道1为 阳性克隆菌液PCR扩增产物;
[0021] 图4为bu地基因阳性克隆菌液PCR验证结果;其中M为DNA Marker DL2000;泳道1和 2为阳性克隆菌液PCR扩增产物;
[0022] 图5为BglII和趾〇1双酶切重组T质粒验证结果;其中化为DNA Marker DL15000,M2 为DNA Marker DL2000,泳道I为重组T质粒双酶切产物;
[0023] 图6为BamH巧日AscI双酶切重组T质粒验证结果;其中M为DNA Marker化15000;泳 道1为重组T质粒双酶切产物;
[0024] 图7为BamHI和AscI双酶切重组过表达质粒验证结果;其中Mi为DNA Marker 化15000,M2为DNAMarker DL2000,泳道1为双酶切重组过表达质粒产物;
[0025] 图8为BamH巧PAscI双酶切质粒pRS抑uet-1结果;其中M为DNA Marker DL15000;泳 道1为BamH巧日AscI双酶切质粒pRS抑uet-1产物;
[0026] 图9为重组过表达质粒PCR扩增biulB结果;其中M为DNA Marker DL2000;泳道1、2为 PCR扩增产物bu地;
[0027] 图 10为Bgin和化〇1 双酶切pRlSW-budA结果,其中Mi为DNA Marker DL15000;泳道 1 为Bgin和化〇1 双酶切质粒pRlSW-budA产物;M2为DNAMarker DL2000
[002引 图 11 BglI巧肋hoi双酶切pRlSW-bu地结果,其中M:DNA Marker DL15000;l:BglII 和化oI双酶切质粒pRlSW-bu地产物;
[0029] 图12为BglII和XhoI双酶切重组过表达质粒验证结果;其中M:DNA Marker DLl 5000; I:双酶切产物;
[0030] 图13为AscI单酶切重组过表达质粒验证结果;其中M:DNA Marker化15000; 1:单 酶切产物;
[0031] 图14为重组过表达质粒PCR扩增budA和biulB结果;其中M:DNA Marker DL2000,1、 2: PCR扩增产物budA; 3、4: PCR扩增产物bu地;
[0032] 图15为Kan抗性筛选工程菌株;
[0033] 图16为SDS-PAGE鉴定BudA、BiulB蛋白的表达;其中M:蛋白Marker; 1:原始菌株提取 蛋白;2:工程菌株提取蛋白。
[0034] 图17为出发菌株和重组菌株的葡萄糖消耗及2,3-下二醇产量对比,其中O表示出 发菌株K.oxytoca皿79的葡萄糖消耗,□表示重组菌的葡萄糖消耗,?表示出发菌株 K.O巧toca皿79的2,3-下二醇产量,表示重组菌的2,3-下二醇产量。
【具体实施方式】
[0035] 本发明技术方案不局限于W下所列举【具体实施方式】,还包括各【具体实施方式】间的 任意组合。
【具体实施方式】 [0036] 一:本实施方式BudAB基因过表达的产酸克雷伯氏菌基因工程菌株 的构建方法,按W下步骤进行:
[0037] 一、从产酸克雷伯氏菌皿79中分别扩增BudA基因和BudB基因,构建克隆载体 pMDl S-T-BudA 和 pMD18-T-Bu 地;
[003引二、W表达质粒pRSFDuet-1为骨架,向质粒上的多克隆位点插入目的基因biulB,构 建重组过表达质粒pRlSW-biKlB,WpRlSW-biKlB为骨架,插入目的基因budA构建重组过表达 质粒 pRS 抑 uet-1-BudAB;
[0039] S、将重组过表达质粒pRSFDuet-1-BudAB电转化K.0巧toca皿79感受态细胞;
[0040] 四、BudAB基因过表达基因工程菌株的筛选和鉴定。
[0041] 本实施方式利用过表达技术,结合2,3-下二醇代谢网络W及对克隆载体PMD18-T 和表达质粒pRSFDuet-1图谱分析,构建含有高效表达乙酷乳酸脱簇酶、乙酷乳酸合成酶的 重组过表达质粒BudAB,利用电转化方法将重组表达质粒转入产酸克雷伯氏菌化Iebsiella oxytoca)HD79菌株中,使底物能够更多的流向2,3-下二醇代谢途径,从而提高2,3-下二醇 产量及底物转化率。最终选育出利用葡萄糖为碳源高产2,3-下二醇的产酸克雷伯氏菌工程 困株。
[0042] 步骤一所述产酸克雷伯氏菌HD79已在文献《Klebisella O巧toca HD79乙酸激酶 部分基因(ack)的克隆与序列分析》(中国农学通报,2015。31 (14): 83-88)中公开。
[0043] 本实施方式中每个步骤的具体内容及结果如下:
[0044] 1、克隆质粒 pMD18-T-budA 和 pMD18-T-bu 地的构建
[0045] WKlebsiella O巧toca 皿79基因组DNA为模板,WbudA-叫、budA-down和bu地-UP、biulB-down为引物对budA和biulB进行PCR扩增,引物序列如表1所示,反应体系组分如表2 所示,反应程序如表3所示,结果如图I,图2所示。由图可知,PCR产物与目的片段budA和bu地 大小相同,分别为78化P和1680bp,与设计结果相符。
[0046] PCR产物加"A",72°C水浴中反应lOmin,用于胶回收的目的片段与PMD18-T进行"T-A"克隆。将目的基因片段进行回收,利用琼脂糖凝胶电泳检测目的片段是否准确回收。回收 片段分别命名为"BudA" "BiKlB"。将验证正确的胶回收片段连接到克隆载体PMD18-T上,反应 体系如表4所示。反应条件:16°C水浴连接过夜。再将连接产物转化至E. COli D册a感受态细 胞中,重组质粒命名为"pTSW-budA" "pTSW-bu地",进行阳性克隆菌液PCR验证,验证体系如 表5所示,反应程序如表6所示,结果如图3、4所示。选用Bgin和趾〇1对克隆质粒pTSW-budA 进行双酶切,用83抽11和43(31对克隆质粒9了5¥-1311地进行双酶切酶,反应条件为37°(:水浴地, 反应体系见表7、表8,结果见图5、6。由图5可知,酶切产生两条清晰条带,大小分别与pMD 18-T和budA基因片段相符。说明budA基因片段与克隆质粒PMD18-T连接成功。由图6可知,酶切 产生两条清晰的条带,其大小分别与质粒PMD18-T和bu地片段相符,说明目的基因bu地已与 PMD18-T连接成功。
[0047] 表1引物序列 [004引
[0化2] 表3budA/bu地基因克隆的反应程序 I 1
[0062] 表8重组克隆质粒biulB酶切反应体系
[0063]
[0064] 2、过表达质粒pRS抑uet-1-budAB的构建
[0065] W表达质粒pRSFDuet-1为骨架,向质粒上的多克隆位点插入目的基因bu地,构建 重组过表达质粒9315胖-扣地,^91?15胖-扣地为骨架,插入目的基因扣(^构建重组过表达质 粒pRS抑uet-1-budAB。
[0066] (1)重组过表达质粒pRS抑uet-1-bu地构建
[0067] 用限制性内
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