一种农杆菌介导侵染转化蒙古柳的方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及植物基因工程领域，特别是设及一种细菌介导侵染转化蒙古柳的方 法。
【背景技术】
[0002] 蒙古柳（Salix mongolica)，杨柳科（Salicaceae )，柳属（Salix)，属种名定名： Salix mongolica f.sericea Qiang.et Skv。松嫩苏打盐碱草甸草原上的乡±灌木树种， 小枝细长，叶线形或线状披针形，长5-15厘米，宽5-9毫米，幼叶有绒毛，后无毛，表面绿色， 背面苍白色，边缘有腺银齿;叶柄长8-12毫米。花先叶开放，接近同时开放，无花序梗，基部 常有3个小叶；雄花序长2-3厘米，粗2-3毫米;雄蕊2个完全合生，雌花序长2.5-3.0厘米，粗 约4毫米;子房有毛，无柄，花柱无或极短，柱头头状;巷片同雄花。分布:黑龙江、吉林、迂宁、 河北等省;蒙古，苏联也有。蒙古柳的粗蛋白的含量>15%，叶中赖氨酸含量在2%左右，接近 草木犀和首猜的水平，运一特点表明可W作为木本饲料，也是青黄不接的冬春两季草本饲 料缺陷时的重要补充。
[0003] 植物遗传转化的基础是相应外植体的离体再生，只有高频的外植体离体再生系 统，才能建立高效率的遗传转化体系。自从1985年化rsh等人首创了农杆菌叶盘转化法，大 大推动了农杆菌介导转化方法的应用，并促使植物遗传转化的研究得到了迅速发展，而且 已成为现在广为应用的首选方法之一。目前国内外已有关于树木组织培养及离体再生方面 相关报道，自从化rson等于1986年证实杨树可W进行遗传转化和外源基因在林木细胞中表 达W来，林木基因工程研究已经取得很大进展。现已对杨树、火炬松、花旗松、白云杉、档木、 刺槐、麻栋、按树、欧洲赤松、兰伯氏松、挪威云杉等20多个树种进行了转化研究。还有金丝 垂柳JlOlO和旱柳建立了农杆菌侵染介导的遗传转化体系，并通过GUS组织化学染色转基因 愈伤组织进行了初步检测。但是，仍未见蒙古柳的遗传转化受体再生体系建立的报道。基因 工程的发展和应用为林木育种开辟了一条新的途径。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的是为了解决现有技术中没有蒙古柳的遗传转化受体再生体系的建 立方法，而提供了一种农杆菌介导侵染转化蒙古柳的方法。
[0005] 本发明利用农杆菌介导侵染转化外植体为叶片诱导愈伤组织，共培养和筛选转化 愈伤组织，并诱导分化抗性丛生芽，在生根培养培养基上再生成植株，GUS染色检测转化再 生植株表明有35S启动下0-半乳糖巧酶活性。
[0006] 本发明的农杆菌介导侵染转化蒙古柳的方法按如下步骤进行：
[0007] -、人工培育蒙古柳无菌苗的叶片愈伤组织的诱导：蒙古柳种子用体积分数为 69%~71%的酒精和体积分数为2%~4%的次氯酸钢消毒、灭菌后，在1/2MS培养基上发芽 后，生长到4叶期或5叶期的无菌苗，剪取无菌苗长X宽为（0.5cm ±0.1 cm)X(0.5cm ± 0.1cm)的叶片在MSYDl培养基上诱导愈伤组织;27.5°C~28.5°C条件下，先光照条件下培养 14h，再暗条件下培养IOh，运样光暗条件交替培养20~25天，然后更换一次培养基，60~65 天诱导出愈伤组织；
[0008] 二、农杆菌侵染转化和共培养:挑取含PBI121质粒的农杆菌，单克隆培养于含有 50mg/L± 2mg/L卡那霉素和100mg/L± 2mg/L利福平的YEP液体培养基中；在27.5°C~28.5°C 条件下，W20化pm/min培养，至农杆菌菌株浓度为在7101紫外分光光度计A = 600下，测得参 数OD值为0.5~0.別寸，在YEP液体培养基中加入50化± 浓度为lOOmM/L ± 5mM/L的乙酷下 香酬继续培养1~2小时;将培养基转入无菌的离屯、管中，常溫下，45(K)rpm/分钟，离屯、15min ~20min收集农杆菌；W液体MS培养基重新悬浮农杆菌，调节农杆菌菌株浓度为在7101紫外 分光光度计A = 600下，测得参数OD值为0.5~0.別寸;无菌操作台中，用綴子将步骤一诱导出 的愈伤组织夹成直径为3mm~5mm的块状，加入悬浮好的农杆菌菌液10~20ml，同时加入20]i L± 浓度为lOOmM/L的乙酷下香酬，在侵染5min~15min后，常溫下，W50巧m/min培养 5min~IOmin;弃去全部农杆菌菌液，用无菌滤纸吸去愈伤组织表面残留的菌液，然后将愈 伤组织转入铺有用MS培养液体充分浸透过的无菌滤纸的愈伤组织筛选培养基MSYDl上，在 24°C~26°C条件，全天黑暗培养2-3天，得到共培养的愈伤组织；
[0009] =、脱菌与抗性丛生芽的分化:将步骤二共培养的愈伤组织放到无菌蒸馈水中洗 去表面的菌，然后加入浓度为1000mg/L±10mg/L的簇节青霉素的溶液中振荡洗菌20min~ 3〇min，再用无菌蒸馈水洗2~3次，放在灭菌滤纸上吸干，接种到筛选愈伤诱导培养基 MSYD2,在24°C~26°C下，先光照条件下培养lOh，再暗条件下培养1地，运样光暗条件交替培 养21天~22天;将抗性愈伤组织转接到筛选分化培养基MSFH3上，在7101紫外分光光度计入 = 600下，测得的OD值为0.5~0.別寸，在24°C~26°C条件，先光照条件下培养lOh，再暗条件 下培养1地，运样光暗条件交替培养20~25天，继代培养1次~2次，直到分化出抗性丛生芽；
[0010] 四、抗性丛生芽生根培养获得抗性转化子:取在浓度为50mg/L±2mg/L的卡那霉素 上抗性生长的单个芽接种到生根培养基上MSSG4,在24°C~26°C条件，先光照条件下培养 IOh，再暗条件下培养Hh，运样光暗条件交替培养20天~22天长出主根;进一步接种到状苗 培养基MSSG5,在22°C~24°C条件下，先光照条件下培养化，再暗条件下培养16h，运样光暗 条件交替培养20~25天，得到转化植株;通风炼苗后，移栽至溫室花盆中培养成一年生苗， 即获得了抗性转化子。
[0011] 本发明的含PBI121质粒的农杆菌是将PBI121质粒通过常规方法转入农杆菌中获 得的。
[0012] 本发明相对于现有技术的优点：
[0013] 本发明建立的蒙古柳的遗传转化方法，转化效率达到10%左右，为采用转基因方 法对耐苏打盐碱植物蒙古柳的遗传改良和获得新品系奠定了基础。
【附图说明】
[0014] 图1为由蒙古柳愈伤组织诱导出的叶片；
[0015] 图2为由蒙古柳叶片诱导出的愈伤组织；
[0016] 图3为筛选分化到的抗性胚芽；
[0017] 图4为筛选分化到的抗性丛生芽；
[0018] 图5为由蒙古柳叶片愈伤组织分化成再生植株
[0019] 图6为由蒙古柳叶片愈伤组织分化成再生植株盆苗
[0020] 图7为工作菌液侵染时间对Kana抗性转化子的分化率的影响
[002。 图8为转gus基因抗性Tl代植株的PCR检测电泳结果，其中，1为DNA Marker 化2000、2为阳性对照株系、3为阴性对照株系、4~11为抗性Tl代植株；
[0022] 图9为转gus基因抗性Tl代植株的PCR检测电泳结果，其中，1为DNA Marker 化2000、2为阳性对照株系、3为阴性对照株系、4~10为抗性Tl代植株；
[0023] 图10为2 XCTAB法提取转化GUS基因的幼苗叶片基因组DNA，用BamHI/HindIII酶切 1 Oyg基因组DNA电泳图；其中，1为DNA Marker，ADNA的HindIII酶切、2为阴性对照株系，3~7 为转gus基因抗性植株的DNA;
[0024] 图11为2 XCTAB法提取转化GUS基因的幼苗叶片基因组DNA，用BamHI/HindllI酶切 IOyg基因组DNA图；其中，1~为阴性对照株系、2~6为转gus基因抗性植株DNA的Southern杂 交结果；
[0025] 图12为取Biozol法制备的转GUS基因蒙古柳Tl代株系的总RNA变性，甲醒-琼脂糖 变性胶RNA电泳结果;其中，1为阴性对照株系、2~6为转gus基因抗性植株2~6植株的RNA;
[0026] 图13为用Biozol法制备的转gus基因蒙古柳Tl代株系的总RNA变性，甲醒-琼脂糖 变性，Nouthern杂交结果其中，其中，1为阴性对照株系、2~6为转gus基因抗性植株2~6号 植株；
[0027] 图14为农杆菌介导的GUS染色分析图，愈伤组织GUS瞬时表达的染色图片；
[0028] 图15为农杆菌介导的GUS染色分析，分化的胚的染色图片；
[0029] 图16为农杆菌介导的GUS染色分析，抗性芽GUS染色图片；
[0030] 图17为农杆菌介导的GUS染色分析，再生植株GUS染色图片；
[0031] 图18为农杆菌介导的GUS染色分析，再生植株GUS染色图片；
[0032] 图19为农杆菌介导的GUS染色分析，野生型对照，脱色后的图片。
【具体实施方式】
[0033] 本发明技术方案不局限于W下所列举【具体实施方式】，还包括各【具体实施方式】间的 任意组合。
【具体实施方式】 [0034] 一:本实施方式的农杆菌介导侵染转化蒙古柳的方法按如下步骤进 行：
[0035] -、人工培育蒙古柳无菌苗的叶片愈伤组织的诱导：蒙古柳种子用体积分数为 69%~71%的酒精和体积分数为2%~4%的次氯酸钢消毒、灭菌后，在1/2MS培养基上发芽 后，生长到4叶期或5叶期的无菌苗，剪取无菌苗长X宽为（0.5cm ±0.1 cm)X(0.5cm ± 0.1cm)的叶片在MSYDl培养基上诱导愈伤组织;于27.5°C~28.5°C，先光照条件下培养14h， 再暗条件下培养lOh，运样光暗条件交替培养20~25天，然后更换一次培养基，60~65天诱 导出愈伤组织；
[0036] 二、农杆菌侵染转化和共培养:挑取含PBI121质粒的农杆菌，单克隆培养于含有 50mg/L± 2mg/L卡那霉素和10