一种高效快速抑制结缕草内源基因表达的方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及一种农杆菌介导的病毒诱导基因沉默技术用于高效快速抑制结缕草 内源基因表达的方法，属于基因工程和生物技术领域。
【背景技术】
[0002] 结缕草(Zoysia japonicaL.)是禾本科画眉草亚科结缕草属的多年生植物，是世 界公认的优良暖季型草坪草，具有广泛的±壤适应性、较强的抗性(抗寒性、抗旱性、耐盐 性、抗病虫害等)和耐粗放管理、省水节肥等优良特性，被广泛用于暖溫带和亚热带的公园 绿化、高尔夫球场和体育场等各种草坪的建设，在草坪产业中具有十分重要的地位。
[0003] 对结缕草抗逆、发育相关重要基因进行功能研究能够为基因工程育种和分子辅助 育种提供重要的候选基因和理论依据。然而目前所建立的农杆菌介导的结缕草遗传转化方 法步骤繁琐且效率低下，严重阻碍了在结缕草植物体内进行目的基因功能的验证。病毒诱 导的基因沉默技术利用病毒感染植物后植物对病毒RNA序列进行特异性识别和降解的机 审Ij，将目标基因序列融入病毒序列中，使感染重组病毒的植物体内病毒RNA和目标基因mRNA 序列均被识别和降解，是一种高效抑制基因表达的技术方法。截至目前，已有多个病毒诱导 基因沉默载体得到构建，成功用于水稻、二穗短柄草、高梁等禾本科植物的基因沉默实验， 然而遗憾的是仍未有结缕草病毒诱导基因沉默技术的报道。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的在于提供一种高效快速抑制结缕草内源基因表达的方法，通过如下 技术方案实现。
[0005] (1)结缕草目的基因片段的克隆。
[0006] 在已知结缕草目的基因序列情况下，设计PCR扩增目的基因片段的上下游引物，设 计原则保证PCR扩增产物长度大于lOObp，同时在上下游引物5'端分别添加限制性内切酶 Mlu巧日化Cl的识别碱基序列ACGCGT和TTAATTAA。提取结缕草RNA，逆转录成CDNA，使用高保 真酶PCR扩增获得目的基因片段。电泳、切胶回收预期大小的PCR产物，连接平末端PCR产物 克隆载体，转化大肠杆菌D册a，涂布抗性平板，挑取克隆，用载体自带引物PCR鉴定获得阳性 克隆后，测序确认PCR产物的正确性。
[0007] 在结缕草目的基因序列未知情况下，可W根据目的基因在其它物种的同源基因序 列设计简并引物先从结缕草CDNA中PCR扩增获得部分基因序列，测序确认序列正确性后遵 照上述方法获得目的基因片段。
[000引（2)病毒诱导基因沉默载体的构建。
[0009]提取上述测序验证的含有结缕草目的基因片段的PCR产物克隆载体质粒和水稻东 格鲁杆状病毒基因沉默载体pRTBV-MVIGS质粒，使用MluI和化Cl两个限制性内切酶于37°C 酶切8小时；电泳、切胶回收目的基因和pRTBV-MVIGS载体酶切片段，使用T4 DNA连接酶将摩 尔比为3:1的目的基因和pRTBV-MVIGS载体酶切回收片段进行连接，连接条件为16°C8小时； 将连接产物转化大肠杆菌D册a，涂布卡那霉素抗性平板，挑取克隆，使用载体酶切位点两侧 序列设计的引物RTBV-F(序列：GGATCCGGGCCCTTAATTA)和RTBV-R(序列： AGGCTGGAGGCATAAACGC)进行菌落PCR，对克隆进行鉴定。
[0010] (3)农杆菌浸染结缕草植株。
[0011] 将连接结缕草目的基因片段的pRTBV-MVIGS质粒转化农杆菌EHA105,涂布卡那霉 素和利福平双重抗性平板，挑取克隆，使用RTBV-F和RTBV-R引物进行菌落PCR检测。将PCR鉴 定阳性克隆按1:100比例扩大培养于含卡那霉素和利福平的LB培养基，28°C培养过夜至 ODsoq约为3。将培养液倒入离屯、管，4000 g、4°C离屯、10分钟收集菌体。用浸染缓冲液（10 mM 吗口林乙横酸，10 mM氯化儀，7.5 ml氯化巧，300 ml乙酷下香酬，pH 5.6)重悬菌体，使ODsoo达 到l.5,倒入烧杯中，室溫静置3小时。将光照16小时/黑暗8小时、28°C条件下培养7天的结缕 草幼苗从化agland培养基中取出，用清水洗去培养基，转移至含有农杆菌浸染液的烧杯中， 用滤网盖住结缕草幼苗使其浸没于液面下。将烧杯放入连有真空累的真空室中，抽真空5分 钟后，将幼苗取出，用清水洗去粘附的浸染液，重新转移至化agland培养基中，于光照16小 时/黑暗8小时、28°C条件继续培养21天。将含农杆菌的浸染废液用高溫蒸汽灭菌后再予W 丢弃。
[0012] (4)基因表达丰度的分子检测。
[0013] 将未浸染的培养28天的结缕草植株W及浸染后继续培养21天的结缕草植株从 化agland培养基中取出，剪下其叶片，提取其RNA，逆转录成cDNA。设计检测目的基因表达的 PCR引物，避开第（1)步中PCR扩增目的基因区段，使用实时定量PCR获得目的基因在对照植 株和浸染病变植株的Ct值。同时使用结缕草内参基因肌动蛋白（actin)的检测引物对内参 基因actin在对照植株和浸染病变植株的表达量进行分析，获得响应的Ct值，用2 AAU算法 计算获得目的基因在对照植株和浸染病变植株中相比actin基因的相对表达量。
[0014] 本发明的技术优势及有益效果在于。
[0015] (1)相比耗时长且步骤繁琐的农杆菌介导的愈伤组织转化方法，本发明所提供的 方法能够在4周内高效的将结缕草内源基因的表达进行抑制，通过观察基因表达被抑制植 株相比对照植株的表型，可W快速地分析基因的功能。
[0016] (2)相比已报道的农杆菌介导的病毒诱导基因沉默方法，本发明所提供的方法使 用真空累辅助农杆菌浸染结缕草叶片，相比注射器直接注射叶片提高了农杆菌浸染效率。 在浸染液配方中，本发明提供的方法新加入了7.5 mM的氯化巧，也极大的提高了浸染效率。
[0017] (3)与结缕草CDNA文库相结合，使用本发明所提供的方法可W快速高通量地筛选 与抗逆、生长发育相关的未知结缕草基因，为分子标记辅助育种和基因工程育种提供大量 的候选基因。
【附图说明】
[0018] 图1为结缕草两个品种八氨番茄红素脱氨酶基因表达被抑制的表型照片。
[0019] 图2为结缕草两个品种八氨番茄红素脱氨酶基因表达被抑制的定量PCR检测结果。
【具体实施方式】
[0020] 下述实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方 法，如无特殊说明，均为常规方法。实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生 化试剂商店购买得到。实施例中的定量实验，均设置=次重复实验，结果取平均值。
[0021] 实施例1结缕草八氨番茄红素脱氨酶基因沉默导致植株叶片白化。
[0022] 国审结缕草品种'兰引3号'结缕草和美国进口品种'Crowne'结缕草:江苏省中国 科学院植物研究所草业研究中屯、。pRTBV-MVIGS质粒：印度德里大学南方校区植物分子生物 学系（参考文献：Purkayastha A, Mathur S, Verma V, Sharma S, Dasgupta I. Virus-induced gene silencing in rice using a vector derived from a DNA virus. Planta, 2010，232: 1531-1540)。大肠杆菌D册a和农杆菌EHA105:江苏省中国科学院植物 研究所草业研究中屯、。
[0023] 一、结缕草八氨番茄红素脱氨酶基因（phytoene desaturase,PDS)的克隆。
[0024] 使用天根生化科技(北京）有限公司的RNAprep植物总RNA提取试剂盒提取'兰引3 号'结缕草叶片的总RNA，操作步骤按试剂盒自带说明书进行。使用宝生物(大连)有限公司 的逆转录试剂盒将结缕草总RNA逆转录为cDNA，操作步骤按试剂盒自带说明书进行。
[0025] 根据NCBI已登录的植物PDS基因的核巧酸序列设计扩增结缕草PDS基因的简并引 物PDS-F-290/PDS-R-980，如表1所示，PCR扩增获得结缕草PDS基因中间区段。电泳，切胶回 收PCR产物，连接全式金(北京)生物技术有限公司的祀ASY-Blunt Simple载体，得到连接产 物，转入大肠杆菌D册a中，抗性筛选挑取阳性克隆，将阳性克隆进行液体培养，提取阳性克 隆质粒进行测序。 「nn)Al 与巨1 吕I味如方||与巨
[0027]采用RACE PCR的方法获取结缕草全长PDS基因序列，具体步骤如下： 1、根据测序获得的结缕草PDS基因的中间区段核巧酸序列设计扩增结缕草PDS基因全 长的巢式PO?引物5 ' -PDS-1/5 ' -PDS-2和3 ' -PDS-1/3 ' -PDS-2 W及接头引物曰(1曰口1〇'-〇11邑〇肌、日(1日91:〇1-1和日(1日91:〇1-2，如表1所示； 2、 3'RACE使用接头引物adaptor-oligodT进行拟转录，使用宝生物（大连)有限公司的 逆转录试剂盒按试剂盒自带说明书进行。5'RACE先使用基因特异性引物5'-PDS-l进行逆转 录，反应条件同上，接下来加入化L 10 X buffer ,IyL dATP和IyL末端脱氧核巧酸转