一种改良棉籽营养品质的方法及其用图
【技术领域】
[0001] 本发明属于植物基因工程技术领域，具体设及一种改良棉巧营养品质的方法及其 用途。
【背景技术】
[0002] 类胡萝h素属于类异戊二締化合物，是一类重要的植物天然色素。类胡萝h素是一 类脂溶性色素，其色彩亮丽，主要呈现黄色、澄红色及红色。对于动物和人体来说，类胡萝h 素是重要的健康保护物质。作为人和动物体内唯一的维生素A源，类胡萝h素转化形成的维 生素A是人体和动物不可或缺的营养物质，能够有效地起到视觉和皮肤系统的保健作用。此 夕h类胡萝h素具有抗氧化作用，它的存在能够延缓衰老，降低屯、血管类疾病和癌症的发病 率。但动物体自身不能直接合成类胡萝h素，所需的类胡萝h素均需通过食物链从植物或微 生物中摄取。通过微生物发酵只能获得e-胡萝h素、邮青素等少数几种类胡萝h素，远不能满 足需求。植物中直接提取的类胡萝h素安全可靠，生理药理活性明显。然而植物体中类胡萝h 素含量有限，培育类胡萝h素含量丰富的农作物具有重要应用价值。
[0003] 棉花是世界上最重要的农作物之一，是人类获取天然纤维的主要来源。作为棉花 生产过程中最大的副产物，棉巧具有巨大的可利用价值。棉巧中含有丰富的蛋白质及油脂 等营养物质，是棒油和制取饲料的重要原料。棉巧中类胡萝h素含量约15yg/g。培育棉巧中 高类胡萝h素的棉花品种，加大棉巧的综合利用，将有益于提升棉花种植的经济效益。
[0004] 近年来，植物中类胡萝h素代谢工程的主要目标是调控合成途径中结构基因的表 达。目前，关于利用类胡萝h素合成酶基因的表达来调控类胡萝h素合成在诸多植物上已有 较多成功的报道。例如，"黄金大米"，将Lcyb、Psy、吐tl(Pds)基因共转化入一个梗稻品种， 得到金黄色的胚乳。分析表明，该胚乳中包含多种类胡萝h素，且含量丰富。专利公开号为 CN101979601A的中国专利申请公开一种提高番茄类胡萝h素含量的方法，是利用基因工程 手段构建隐花色素基因1，隐花色素基因1的簇基端和隐花色素基因2的簇基端的过量表达 载体，转化番茄，获得转基因番茄，实现了转基因番茄果实中番茄红素及总类胡萝h素含量 较大幅的提局。
[0005] 八氨番茄红素合成酶(PSY)是类胡萝h素生物合成途径中所设及的重要限速酶，它 催化2分子的彼牛儿彼牛儿焦憐酸(GGPP)缩合形成第一个类胡萝h素一一八氨番茄红素。在 番茄、油菜、拟南芥和马铃馨中过量表达八氨番茄红素合成酶，相应组织中积累类胡萝h素 的水平显著提高。可见，改变八氨番茄红素合成酶表达水平将深刻影响植物体中类胡萝h素 含量。但到目前为止，尚未见有关于棉巧类胡萝h素含量改良的报道。
【发明内容】
[0006] 本发明要解决的技术问题是为棉巧营养改良提供一种新选择。
[0007] 本发明的技术方案是一种改良棉巧营养品质的方法，构建种子特异启动子驱动八 氨番茄红素合成酶基因PSY的植物表达载体，并转化棉花，提高棉巧中类胡萝h素含量，所述 PSY基因为棉花GhPSY2基因。
[000引具体的，所述的化PSY2基因具有如SEQ ID No. 1所示的核巧酸序列。
[0009] 具体的，调控PSY基因表达的启动子为菜豆种子特异启动子。
[0010] 优选的，所述的种子特异启动子为菜豆储存蛋白e-菜豆蛋白e-phaseolin基因的 启动子pv，具有如SEQ ID No.2所示的核巧酸序列。
[0011] 具体的，所述植物表达载体如SEQ ID No.3所示的核巧酸序列。
[0012] 具体的，所述的转化为根癌农杆菌介导的遗传转化。
[0013] 本发明还提供了所述的方法在提高棉巧类胡萝h素含量中的用途。
[0014] 本发明的有益效果:本发明通过研究和分析，采用特异启动子在种子发育时期特 异表达棉花八氨番茄红素合成酶基因化PSY2,获得了棉巧中类胡萝h素含量显著提高的转 基因棉花。试验结果证明，经本发明对目标基因进行调控后，改良的棉巧中类胡萝h素含量 显著提高，棉巧营养得到强化。本发明方法简便易行，效果显著，有产生巨大经济效益的潜 力。
【附图说明】
[0015] 图1 pV:化PSY2的表达载体T-DNA区的基因结构图
[0016] CaMV35S-P，花挪菜花叶病毒35S启动子;2XCaMV35S-P，串联两个花挪菜花叶病毒 35S启动子;CaMV35S-T，花挪菜花叶病毒35S终止子;GhPSY2，棉花八氨番茄红素合成酶基 因；GUS:NPTII，0-葡萄糖酸巧酶与新霉素憐酸转移酶融合基因；LB，T-DNA左边界;No S-T， 农杆菌冠瘦碱合成酶基因终止子;PV，菜豆种子特异启动子;RB，T-DNA右边界。
[0017] 图2 pLGN-pV:化PSY2表达载体构建流程
[001引具体实验方法见实施例2 DCaMV35S-P，花挪菜花叶病毒35S启动子;2 X CaMV35S-P， 串联两个花挪菜花叶病毒35S启动子;CaMV35S-T，花挪菜花叶病毒35S终止子;化PSY2，棉花 八氨番茄红素合成酶基因；GUS:NPTII，e-葡萄糖酸巧酶与新霉素憐酸转移酶融合基因；LB， T-DNA左边界;Nos-T，农杆菌冠瘦碱合成酶基因终止子;pV，菜豆种子特异启动子;RB，T-DNA 右边界。相关酶切位点及位置在各个载体上标出。
[0019] 图3野生型(WT)棉花及pV: GhPSY2转基因棉花
[0020] A:(ihPSY2表达水平（Relative expression)检测；B:野生型或转基因型棉花成熟 种子;C:野生型或转基因型棉花粉碎后的成熟种子;D:用乙酸稀释20倍的棉巧油;E:棉巧油 中类胡萝h素含量。WT:野生型样品；#l、#2:pV:化PSY2转基因棉花的两个株系;*和**显示 与野生型对照间呈显著额极显著差异(t检验，n = 3)。
【具体实施方式】
[0021] 下述实施例中所用到的常规实验操作：
[0022] 1. DNA 的提取
[0023] 基因组DNA采用植物基因组DNA快速提取试剂盒(Aidlab)提取，详细步骤见说明 书。
[0024] 2. RNA 的提取
[0025] RNA采用EASYspin植物RNA快速提取试剂盒(Aidlab)提取，详细步骤见说明书。
[0026] 3. DNA片段的PCR扩增
[0027] 扩增体系如下：l〇XEx PCR buffer(Mg2+打 ee)2.扣L，2.5mmol/L dNTPs 化L， 25mmol/LMgCl2 化L，引物 1(5皿ol/L)lyL，引物2(5皿ol/L)liiL，Ex Taq DNA聚合酶 1U，基因 组DNA约60ng，加入d地2〇至化化。
[002引扩增程序为：94°C，5min; 94°C，30sec，56°C，30sec，72°C，1.5min，35个循环；72°C 延伸lOmin。
[0029] 4. DNA片段的回收、连接和克隆
[0030] 使用BioFlux胶回收试剂盒回收DNA片段。使用T4DNA Iigase进行DNA片段连接。回 收的片段与pUCm-T化海生工)载体建立如下连接体系：10XT4DNA连接缓冲液化L，载体DNA 片段化L，外源连接产物DNA片段化L，T4DNA连接酶化L，用d地2〇补足体积至10化。载体DNA片 段与外源连接产物DNA片段摩尔比为1:3,16°C连接12h。之后将连接产物转化大肠杆菌D册 曰。获得的抗性克隆经液体培养过夜，用BioFlux质粒提取试剂盒提取质粒，酶切验证后，在 Invi trogen公司测序。
[0031] 5 .GUS组织化学染色
[0032] 由于实验室采用的表达载体具有GUS报告基因，一般用GUS组织化学染色检测跟踪 转基因。具体方法:取少量转基因棉花叶片(有伤口）置于96孔板中，加入GUS染液[0.1 mo 1 /L K3^(CN)6,0.1mol/LKJe(CN)6,0.01mol/Lrfe2EDTA，500mg/LX-Gluc，l%l'ritonX-100 (v/v)，0.14mol/L憐酸钢缓冲液(PH7.0)]，在37°C恒溫条件下放置化左右，充分染液后再用 75 %乙醇脱色。植株叶片可被GUS染液染成特异蓝色的植株为转基因阳性。
[0033] 6.棉巧油的抽提及其类胡萝h素含量测定
[0034] 棉巧油提取采用索氏抽提法：
[0035] 1)将折叠好的滤纸包放入玻璃皿中在105°C烘箱中干燥化，取出放入干燥器冷却 至室溫，准确称重记Wi。
[0036] 2)取约3g种子用粉碎机粉碎，过40目筛网，取约Ig样品装入上述已称重的滤纸包 中，放入105°C烘箱中干燥化，取出放入干燥器冷却至室溫，准确称重记W2。
[0037] 3)上述装有样品并称重的滤纸包放入脂肪提取仪(BUCHI B-811抽提系统）中，足 量乙酸浸泡过夜。
[0038] 4)过夜后，70~80°C抽提化，抽提完成后，收集底部油脂（即棉巧油），纸包放入105 °C烘箱中干燥化，取出放入干燥器冷却至室溫，准确称重记化。
[0039] 5)种子中粗脂肪含量（％ ) = (W2-W3)/(W2-Wi) X 100%
[0040] 进一步，将上述抽提获得的棉巧油用乙酸稀释n倍至酶标仪可检测范围，取20化L 于酶标板，酶标仪检测445nm处的吸光值，将吸光值代入标准曲线（参考0-胡萝h素标准曲 线），计算类胡萝h素含量。
[0041] 7.0-胡萝h素标准曲线的制作
[0042] 1)准确称取Im泌-胡萝h素标准品，用乙酸定容于IOml栋色容量瓶，0-胡萝h素浓度 为 lOOjig/ml;
[0043] 2)继续稀释至 7 个浓度梯度:0、0.1、l、3、6、9、12、15iig/mL
[0044] 3)取20化L于酶标板，酶标仪检测445nm处的吸光值；
[0045] 4)线性回归，制作标准曲线。
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