转ics1基因提高青蒿中青蒿素含量的方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及一种生物技术领域的提高青葛素含量的方法，特别是一种转ICSl基因 提高青葛中青葛素含量的方法。
【背景技术】
[0002] 青葛(Artemisia annua L.)是菊科葛属的一年生草本植物。其地上部分所提取的 含有过氧桥的倍半祗内醋氧化物一一青葛素，是目前应用最广泛，疗效最好的抗追疾药物， 特别是对脑型追疾和抗氯哇追疾更加有效。目前，青葛素联合疗法(ACTS)是世界卫生组织 推荐的最有效的治疗追疾的方法。随着对青葛素药理研究的逐步深入，科学家发现青葛素 及其衍生物还具有抗炎、抗肿瘤、抗癌W及免疫调节的功能。
[0003] 然而青葛素在植物青葛中的含量非常低，大规模商业化生产受到了限制，无法完 全满足全球的市场需求。由于青葛素结构复杂，人工合成难度大，产量低，成本高，不具可行 性。通过酵母工程生产青葛素，前期投入成本大，且产量有限不能满足需求。现有技术表明 植物基因工程为提高青葛中青葛素的含量提供了一个可行的方法。
[0004] 青葛具有分泌型腺毛（g 1 a n d U 1 a r t r i C h O m e S )和非分泌型腺毛 (nonglanduladrichomes)。在青葛叶片的正面和背面、茎杆、花上都大量存在分泌型腺毛， 运里是大量次生代谢物的累积场所，青葛素也被认为储存于此处。
[0005] 水杨酸（Salicylic acid, SA)是重要的植物激素，在植物的生长发育上起了非常 重要的作用，并与植物的抗病防御密切相关。异分支酸合成酶（Isochorismate synthase, ICS)是植物水杨酸合成途径的其中一个关键酶，负责将分支酸转化为异分支酸，然后进一 步合成最终产物水杨酸。ICSl基因水杨酸调控的抗逆有关联。对icsl突变体研究发现，缺失 ICSl基因的植株内源水杨酸含量也极低。因此，克隆ICSl基因并转化青葛，对探究水杨酸合 成途径和青葛素途径的代谢协调及基因工程育种具有重要意义。
[0006] 本发明致力于采用基因工程手段，获得青葛素高产的青葛植株，为规模化生产青 葛素提供一条新途径。
【发明内容】
[0007] 本发明的目的在于克服现有技术中的不足，提供一种转ICSl基因提高青葛中青葛 素含量的方法。本发明设及的基因克隆、载体构建、遗传转化、分子检测、青葛素提取及含量 测定用于本发明，建立了稳定提高青葛中青葛素含量的方法，为利用青葛大规模生产青葛 素奠定了基础。
[000引本发明提供一种转ICSl基因提高青葛中青葛素含量的方法，包括W下步骤：
[0009] (1)采用基因克隆方法获得ICSi基因；
[0010] (2)把所述ICSl基因连接于表达调控序列，构建含ICSl基因的植物表达载体；
[0011] (3)将所述含ICSl基因的植物表达载体转化根癌农杆菌，获得含所述ICSl基因植 物表达载体的根癌农杆菌菌株；
[0012] (4)利用所述含ICSl基因植物表达载体的根癌农杆菌菌株转化青葛，获得经PCR检 测的整合外源目的基因ICSl的转基因青葛植株。
[0013] 进一步地，所述I雌1基因的DNA序列如沈Q ID NO. 1所示。
[0014] 进一步地，所述ICSl基因编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
[0015] 进一步地，在所述步骤（1)中，所述基因克隆方法包括W下步骤:提取青葛基因组 总RNA，将所获的青葛基因组总RNA通过反转录酶化反转录获得第一链cDNA，W所述第一链 CDNA为模板，W上游引物和下游引物为引物对，进行PCR扩增，其中所述上游引物的DNA序列 如SEQ ID NO.3所示，所述下游引物的DNA序列如SEQ ID NO.4所示。
[0016] 优选地，在所述步骤（1)中，所述基因克隆方法包括W下步骤:提取青葛基因组总 RNA，将所获的青葛基因组总RNA通过反转录酶化反转录获得第一链cDNA，根据SEQ ID NO. 1 所示的DNA序列，设计扩增出完整编码框的上游引物和下游引物，所述上游引物为SEQ ID NO. 3所示的DNA序列，所述下游引物为SEQ ID NO. 4所示的DNA序列，W所述的第一链CDNA为 模板，W所述上游引物和所述下游引物为引物对，经PCR扩增后进行测序。
[0017] 进一步地，在所述步骤(2)中，所述构建含ICSl基因的植物表达载体包括W下步 骤:先构建中间载体PJET-ICS1，再酶切中间载体PJET-ICSl和表达载体P皿-n-f lag,回收 ICSl基因片段和P皿-n-f lag载体大片段，连接转化，挑取单克隆，提取质粒做PCR检测和酶 切验证，得到含ICSl基因的植物表达载体。P皿-n-flag是对P皿201表达载体在35s启动子后 插入flag改造获得并保存的表达载体。
[0018] 进一步地，在所述步骤(2)中，所述构建含ICSl基因的植物表达载体包括W下步 骤:先通过连接酶将所述步骤(1)中基因克隆获得的ICSl基因片段连接到载体IMET中，得到 中间载体UET-ICSl;再设计引入酶切位点SacI的上下游引物，所述引入酶切位点SacI的上 游引物的DNA序列如SEQ ID NO. 5所示，所述引入酶切位点Sac I的下游引物的DNA序列如SEQ ID NO.6所示，W所述中间载体UET-ICSl为模板，W所述引入酶切位点SacI的上下游引物 为引物对进行PCR扩增，得产物1;再用SacI酶切所述产物1和表达载体P皿-n-flag，得到带 酶切位点SacI的ICSl基因片段和P皿-n-flag载体大片段；回收所述带酶切位点SacI的ICSl 基因片段和所述PHB-n-f lag载体大片段，连接转化，挑取单克隆，提取质粒做PCR检测和酶 切验证，得到含ICSl基因的植物表达载体。
[0019] 进一步地，在所述步骤(4)中，所述转化包括W下步骤:外植体的预培养;农杆菌与 外植体的共培养;抗性再生植株的筛选;其中，
[0020] 所述预培养包括W下步骤:青葛种子用75%乙醇浸泡Imin,再用20%化Cio浸泡 20min，无菌水冲洗3-4次，用无菌吸水纸吸干表面水分，接种于无激素的MS固体培养基中， 25°C光照培养，即可获得青葛无菌苗，待苗长至5cm左右后，剪取无菌苗叶片外植体用于转 化；
[0021] 所述共培养包括W下步骤:将所述叶片外植体转到共培养培养基中，滴加含活化 好的所述含ICSl基因植物双元表达载体的根癌农杆菌工程菌的1/2MS悬液，使外植体与菌 液充分接触，28°C暗培养3天，W滴加在不带有目的基因的根癌农杆菌的1/2MS液体培养基 悬液的叶片外植体为对照；
[0022] 所述筛选包括W下步骤:将所述共培养3天的青葛外植体转入到发芽筛选基上于 25°C光照培养，每两周继代培养一次，经过2-3次继代培养后即可获得潮霉素化yg)抗性丛 生芽，将所述生长良好的Hyg抗性丛生芽剪下转入生根培养基上培养至生根，即可获得Hyg 抗性再生青葛植株。
[0023] 进一步地，在所述步骤(4)中，所述PCR检测包括W下步骤:根据目的基因所在表达 盒p35s-ICSl-nos序列p35s和ICSl分别设计正向引物和反向引物;进行DNA扩增；紫外线下 观察，若目的条带为阳性，则该株系即为所述转基因青葛植株;所述正向引物的DNA序列如 SEQ ID NO.5所示，所述反向引物的DNA序列如SEQ ID NO.4所示。
[0024] 进一步地，还包括步骤(5)对所述转基因青葛中青葛素含量进行高效液相色谱法 及蒸发光散射检测器测定化PLC-ELSD)测定，筛选获得青葛素含量提高的转基因青葛植株。
[0025] 优先地，在所述步骤(5)中，所述HPLC-ELSD测定包括W下条件:所用色谱柱为C-18 反相硅胶柱，流动相选用体积比为70:30的甲醇和水，柱溫30°C，流速1.OmL/min，进样量20y L，蒸发光散射检测器漂移管溫度40°C，放大系数为7，载气压力化ar。
[0026] 本发明的转ICSl基因提高青葛中青葛素含量的方法，采用基因工程方法，将异分 支酸合成酶ICSl基因导入青葛植株中，获得了青葛素高含量显著提高的转基因青葛株系， 转ICSl基因青葛中青葛素的含量最高可达到干重的15.2mg/g，是非转化普通青葛(8mg/g) 的1.90倍，该发明对于为青葛素的规模化生产提供高产、稳定新药源具有重要意义。
【附图说明】
[0027] 图1是携带有转ICSl基因的青葛与非转化普通青葛的青葛素含量检测结果图。
【具体实施方式】
[0028] 下面结合附图和实施例对本发明的技术内容做进一