示，本研究构建了两种报告基因体系，其中报告基因E2为红色巧光蛋 白，用于快速定性观察和判断;Luc为巧光素酶，用于定量测定。双酶切、PCR鉴定结果显示重 组质粒构建成功。送生工生物工程(上海)股份有限公司测序，测序结果经过比对显示所插 入的各启动子序列与NCBI收录的一致，表明成功构建重组质粒P化-E2、p化-Luc。
[0032] 实施例2稳定细胞株的建立 2.1实验方法 将重组质粒pNp-E2、p化-Luc分别转染肥K293细胞，具体操作见Lipofectamine?2〇〇〇 试剂说明书。将转染后36~48小时的细胞用膜酶消化后，根据转染效率，适量的将其在IOcm 培养皿中分散培养，细胞贴壁后即加入80化g/化G418开始进行筛选，2-3周后，细胞在培养 皿中形成间距较远的单独群落;在倒置显微镜下选出合适的细胞群落，用记号笔在培养皿 底部标出该细胞群落的位置;在严格无菌的操作中，用手术刀片将ImL吸头削成适当的斜 面，用带斜面的枪头仔细地将标记点周围的细胞全部定点清除；用培养基将刮下的细胞尽 量漂洗、清除，保留标记的细胞，加入新鲜培养基培养;在选中的细胞群落逐渐扩大时，实时 检测其周围的杂细胞并及时清除；当该细胞群落长成适当大小时，用膜酶定点消化并梯度 稀释到96孔板中，待细胞贴壁后，巧光显微镜下挑选出含单个细胞的孔，标记并重点检测、 培养;细胞在96孔板中长成适当大小的克隆时，将其转入24孔板中扩大培养，然后再将其转 入6孔板中扩大培养并及时冻存。
[0033] 2.2实验结果 如图2所示，巧光场和明场观察结果显示了稳定转染的单克隆细胞株的构建过程，可看 出单克隆逐渐长大。
[0034] 图3同样表明，本发明构建得到了稳定转染pNp-E2的皿K-293细胞（简写为293-P化-E2细胞）。
[0035] 实施例始田胞模型的功能鉴定 3.1实验方法 阳性刺激物化E可上调细胞中的NGF的表达，因此可用于验证筛选模型是否成功建立。 若成功建立筛选模型，在给予阳性刺激物刺激后，细胞中NGF的表达会上调。
[0036] 为验证模型的有效性，分别考察两种报告基因细胞模型293-PNP-E2细胞和293-P化-Luc细胞对于已知阳性刺激物的响应。
[0037] 293-P化-E2细胞和293-P化-Luc细胞及肥K-293细胞的培养均采用肥K-293细胞培 养条件进行，即DMEM高糖培养液化yclone公司）+ 10%FBS(Sciencell公司）+ 1X1〇5u/L的 青、链霉素化yclone公司），在37°C、5%C02培养箱中进行培养。每天观察细胞数量及形态， 待细胞生长汇合至80%时，用0.25%的膜蛋白酶化yclone公司）进行消化传代或根据实验 需要接种于24孔或96孔板中。取处于对数生长期的细胞进行实验。
[0038] 实验设空白对照组和实验组，每个浓度3个复孔。CLE用培养基稀释成相应浓度的 溶液。实验组分别如下加入不同浓度的阳性刺激物，空白对照组加入相应体积的培养基。实 验组中化E的最终工作浓度分别为化M、10咖、1 OOiiM，处理时间为2地。
[0039] 利用巧光显微镜直接观察293-P化-E2细胞对阳性刺激物的反应;利用巧光素酶检 测试剂盒检测293-P化-Luc细胞对阳性刺激物的反应。
[0040] 巧光素酶活性检测步骤如下： 将R邱OTter Lysis 5XBuffer稀释为Lysis I XBuffer,用Lysis I XBuffer收集孔板 中的细胞，置于0.5mL的EP管中，-80°C过夜，备用。将实验组和对照组处理后的冻存于-80°C 的293-P化-Luc细胞取出，置于4°C融化，待完全融化后在满旋仪上满旋15s，4°C，12000 Xg 离屯、3min得上清液。精密吸取20化上清于白色的微孔板中，每个样品3个平行。设置每孔50y L LuciferaseAssay Substrate,自动进样。酶标仪测定巧光素酶的活性。
[0041 ] 利用蛋白质浓度测定试剂盒(Pie:rce?BCA Protein Assay Kit,Thermo)进行蛋白 含量测定。首先根据试剂盒说明书进行标准曲线溶液的配制。然后精密吸取25化的标准液 或样品上清液于96孔板中，每个样品3个平行，每孔加入20化L的工作液(working regent)， 轻摇，于37°C解育30min，冷却至室溫后，用酶标仪测定562皿处的吸光度值。WBSA含量为横 坐标，W吸光值为纵坐标，绘制标准曲线。根据标曲方程计算出样品的蛋白质含量。
[0042] 最终的巧光素酶活性为:相对巧光素酶活单位=巧光素酶活性/蛋白含量。
[0043] 3.2实验结果 如图4所示，当加入化E处理2地后，无论是对照组还是IOOiiM CLE处理组，随时间的增 加，红色逐渐变亮，CLE处理组亮度高于空白对照组。运表明本发明成功构建了 293-pNp-E2 细胞，且该细胞模型能对阳性刺激物发生响应。
[0044] 如图5所示，空白组也显示了突出的巧光素酶活性，巧光素酶的表达随阳性刺激物 浓度的升高而增加，高剂量下与未处理的空白组相比，其差异具有统计学意义(P<〇.05)。运 表明本发明成功构建了293-P化-Luc细胞，且该细胞模型能对阳性刺激物发生响应。
[0045] 实施例4本发明细胞模型用于药物的筛选 4.1实验方法 从中药中提取分离出的5个单体成分化rpetetrione、化-X、毛蕊异黄酬巧、葛根素芹菜 糖巧、芒柄花巧。用构建的293-P化-Luc细胞模型对该5个单体成分进行活性筛选，筛选浓度 为1 OiiM，处理时间为24h，具体实验步骤参照实施例3。
[0046] 按照上述巧光素酶活性测定方法测定加药处理各组细胞巧光素酶活性，与阴性溶 剂对照组比较，计算各单体成分对NGF基因转录活性的影响，W上调改变率含150%作为筛 选活性判断标准。
[0047] 上调改变率=(实验组相对巧光素酶活性/对照组相对巧光素酶活性）X 100%。 [004引 4.2实验结果 如图6所示，从中药中提取的运5种单体成分中，只有芒柄花巧处理组的上调改变率大 于150%，呈筛选阳性，也即表明，只有芒柄花巧具有良好的神经保护活性。
[0049]综上，本发明构建了 WNGF启动子为祀点的细胞筛选模型，可系统、有效、多方面地 筛选具有神经保护活性的药物。
【主权项】
1. 一种基因构建物，其特征在于:所述基因构建物从5 '端到3 '端依次含有:NGF启动子 基因-615 bp~+50 bp序列和报告基因序列。2. 如权利要求1所述的基因构建物，其特征在于:所述报告基因选自：荧光蛋白基因和/ 或焚光素酶基因；进一步地，所述焚光蛋白基因为绿色焚光蛋白基因或红色焚光蛋白基因， 所述荧光素酶基因为萤火虫荧光素酶基因。3. -种重组载体，其特征在于:所述的重组载体含有权利要求1或2任一项所述的基因 构建物。4. 一种稳定的细胞，其特征在于:所述的细胞含有权利要求3所述的重组载体或其基因 组中整合有权利要求1或2任一项所述的基因构建物。5. 如权利要求4所述的稳定的细胞，其特征在于:所述的细胞选自HEK293细胞、He la细 胞、CHO细胞或干细胞中的任一种。6. 构建权利要求3所述重组载体的方法，其特征在于:它包括如下步骤： (1) 合成NGF启动子基因-615 bp~+50 bp序列； (2) 将步骤(1)合成的序列与带有报告基因的报告载体分别进行酶切，连接报告载体与 启动子片段，转化大肠杆菌，抗性筛选，挑选阳性转化子，提取质粒，即得重组载体； 进一步地，步骤(2 )中，所述报告载体为带有报告基因的pSC基础质粒。7. 构建权利要求4所述的稳定的细胞的方法，其特征在于:将权利要求3所述的重组载 体转染HEK293细胞、Hela细胞、CHO细胞或干细胞中的任一种。8. 权利要求4所述的稳定的细胞的用途，其特征在于:所述的细胞用于筛选可提高NGF 表达水平或具有神经保护活性的药物。9. 一种筛选可提高NGF表达水平或具有神经保护活性的药物的方法，其特征在于，所述 方法包括如下步骤： (1) 将候选药物给予权利要求4或5所述的稳定的细胞； (2) 检测所述细胞中报告基因的表达情况； (3) 判断结果，若所述候选药物能提高报告基因的表达，则表明该候选药物可提高NGF 表达水平或具有神经保护活性； 进一步地， 步骤(1)包括将候选药物加入权利要求4或5所述的稳定的细胞培养体系中共培养； 步骤(2)包括检测实验组的报告基因的表达，并与空白对照组比较，所述空白对照组是 不添加所述候选药物的与实验组相同条件培养的权利要求4或5所述的细胞； 若实验组中报告基因的表达水平高于对照组，表明候选药物可提高NGF表达水平或具 有神经保护活性。10. 根据权利要求9所述的方法，其特征在于:实验组的报告基因的表达水平/对照组的 报告基因的表达水平2 150%，表明候选药物可提高NGF表达水平或具有神经保护活性。
【专利摘要】本发明提供了一种用于筛选具有神经保护活性的药物的细胞模型及其用途和使用方法，本发明构建的细胞模型以NGF启动子为靶点，可系统、有效、多方面地对具有神经保护活性的药物进行筛选。
【IPC分类】C12N15/12, G01N33/68, C12N5/10, C12N15/53, C12Q1/66, C12N15/85, C12N15/66
【公开号】CN105695508
【申请号】CN201610064398
【发明人】谭锐, 顾健
【申请人】西南交通大学
【公开日】2016年6月22日
【申请日】2016年1月29日