一种获得高纯度心肌细胞的方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及细胞培养领域，尤其设及一种获得高纯度屯、肌细胞的方法。
【背景技术】
[0002] 屯、脏毒性是药物研发失败的主要原因之一，也是临床前安全评价研究的难题之 一。随着技术的发展，诱导型人多能干细胞和人胚胎干细胞定向分化成屯、肌细胞已经建立 起完整的流程。运样通过多能干细胞生成成熟屯、肌细胞就能为药物研发提供细胞来源。通 过分化人多能干细胞生成的屯、肌细胞就能作为药筛模型大大减少药物开发的时间和成本。 所W越来越多的研究者开始使用诱导型人多能干细胞和人胚胎干细胞定向分化成屯、肌细 胞进行药物的屯、脏毒性测试。
[0003] 此前已经有研究者通过同源重组的传统方法使用人胚胎干细胞构建出NKX2.56WP /W的细胞株，但是由于人胚胎肝细胞的来源W及伦理问题，使用人胚胎干细胞进行治疗受到 了一些限制。
[0004] 此外，使用传统的同源重组技术筛选过程、载体构建过程都极为复杂，DNA的体外 扩增工作量极大，运样整个标记细胞株的构建过程就会非常耗时，构建培养NKX2.56WP/W细 胞株效率较低。
[0005] 为此，需要一种新的能高效使用诱导型人多能干细胞定向分化成为屯、肌细胞的方 法。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的在于提供一种高效的使用诱导型人多能干细胞定向分化成为屯、肌 细胞，旨在解决现在使用人胚胎干细胞进行细胞分化的问题。
[0007] 本发明是运样实现的：一种获得高纯度屯、肌细胞的方法，包含W下步骤： A. 构建TALEN质粒，所述TALEN质粒的祀向为屯、肌细胞特异性基因外显子； B. 构建供体质粒，所述供体质粒包含所述TALEN质粒的切割位点左右各1000 bp序列的 同源序列构成的同源臂、巧光蛋白基因、蛋白质合成抑制剂抗性基因； C. 核转染，将所述供体质粒和TALEN质粒共转染入人诱导多能干细胞中，获得第一改性 诱导性人多能干细胞； D. 筛选获得含有巧光蛋白基因和蛋白质合成抑制剂抗性基因的第=改性诱导性人多 能干细胞； E. 将所述第=改性诱导型人诱导多能干细胞定向分化成屯、肌细胞。
[000引本方法通过基因敲入的方式同时将巧光分子编码序列和蛋白质合成抑制剂抗性 基因定点整合到要标记的基因的起始密码子基因序列内，使得分化得到的屯、肌细胞能够同 时拥有巧光和抗药性双重标记。由于引入了巧光基因，所W可W通过巧光分子的表达强度 和表达地点定位和定量我们要研究的基因。此外，本发明利用TALEN方法来提高同源重组效 率，将同源重组的供体质粒的同源臂设计改变到化B左右，极大的降低了实验的难度，并且 使得实验效率有了明显提升。运比现有技术有了明显进步。
[0009] 本发明的进一步改进在于:所述蛋白质合成抑制剂抗性基因可为嚷岭霉素抗性基 因、新霉素抗性基因、白喉霉素抗性基因。其中优选的为嚷岭霉素抗性基因，英文为 puromycin基因。嚷岭霉素puromycin是一种蛋白质合成抑制剂，它具有与tRNA分子末端类 似的结构，能够同氨基酸结合，代替氨酷化的tRNA同核糖体的A位点结合，并渗入到生长的 肤链中。虽然嚷岭霉素能够同A位点结合，但是不能参与随后的任何反应，因而导致蛋白质 合成的终止并释放出C-末端含有嚷岭霉素的不成熟的多肤。在运里我们通过加入 puromycin基因W及其他蛋白质合成抑制剂抗性基因起到筛选的作用。为了书写方便，下文 中统一用puromy C in基因为例指代蛋白质合成抑制剂抗性基因。
[0010] 本发明的进一步技术方案是:所述步骤帥供体质粒还包括TALEN切割位点左右各 1000 bp序列基因、终止子SV40pA，LoxP序列基因，憐酸甘油激酶启动子及其控制下的新霉 素基因。运些基因主要为了辅助筛选需要的改性诱导型人诱导多能干细胞。通过步骤C得到 的改性诱导性人多能干细胞包括成功转染的和未发生转染的，而发生了转染的改性诱导性 人多能干细胞又包括=类，分别是发生了定点整合的细胞、发生了非定点整合的细胞W及 因为有供体质粒残留到细胞中使的细胞也具有抗药性但实际上未发生整合的细胞。但是我 们只需要发生了定点整合的细胞，所W需要通过一些方法来筛选出目标细胞。所W我们引 入了终止子SV40pA，LoxP序列基因，憐酸甘油激酶启动子及其控制下的新霉素基因W进行D 步骤的工作。
[0011] 本发明的进一步技术方案是:所述步骤D包括W下分步骤:Dl.所述第一改性诱导 性人多能干细胞经过新霉素富集后，通过单细胞克隆及PCR鉴定，获得所述供体质粒敲入的 第二改性诱导性人多能干细胞;运一步可W将未成功转染W及供体质粒残留到细胞中使的 细胞也具有抗药性但实际上未发生整合的细胞的细胞除去，只留下成功转染的细胞。
[0012] D2.通过核转染转入CRE重组酶，切除憐酸甘油激酶启动子及其控制下的新霉素抗 性基因，获得屯、肌细胞特异性基因具有巧光蛋白基因和蛋白质合成抑制基因标记的第=改 性诱导多能干细胞株。
[0013] 本发明的进一步技术方案是:E步骤中所述第=改性诱导性人多能干细胞利用巧 光蛋白基因进行流式细胞术分选纯化屯、肌细胞，也可W通过蛋白质合成抑制剂抗性基因的 药物抗性获得高纯度的屯、肌细胞。
[0014] 本发明的进一步技术方案是:所述巧光蛋白基因为绿色巧光蛋白基因、红色巧光 蛋白基因、远红外色巧光蛋白基因、蓝色巧光蛋白基因、黄色巧光蛋白基因、澄色、巧光蛋白 基因，澄红色巧光蛋白基因，翠绿色巧光蛋白基因中的一种。其中优选的为绿色巧光蛋白基 因eGFP。绿巧光蛋白是一个生物发光系统，附带有激发后能发射生物巧光的发光色基，其发 光过程不同于其它生物发光组织，是不需巧光素酶参与的。eGFP基因产生的巧光明显，颜色 对比度较大，比较适合进行观察和计算。
[0015] 本发明的进一步技术方案是:所述绿色巧光蛋白基因和蛋白合成抗性基因可通过 P2A，F2A，E2A，和T2A序列进行共表达。
[0016] 本发明的进一步技术方案是:所述屯、肌细胞特异性基因为Nkx2.5。Nkx2.5参与了 屯、脏形成，包括右侧环化、屯、腔分化、屯、脏间隔功能成熟W及工作屯、肌和传导系统的维持等 过程，是多能干细胞分化成为屯、肌细胞的重要工具。
[0017] 本发明的有益效果是:首先，本发明使用诱导型人多能干细胞定向分化成为屯、肌 细胞，来源方便，使用人体尿液即可，不存在伦理上问题。
[0018] 其次，本发明利用最新的基因修饰工具TALEN，将同源重组的供体质粒的同源臂设 计改变到化B左右，使得进行同源重组需要的筛选技术和基因操作技术大为降低，极大的提 高了同源重组的效率。
[0019]
【附图说明】
[0020] 图1是本发明实施例提供的TALEN质粒构建序列图。
[0021 ] 图2是本具体实施例中Single Strand Annealing测试图解。
[0022] 图3是本发明实施例提供的293T细胞在转染后的细胞巧光照片。
[0023] 图4是本发明实施例提供的Donor质粒构建示意图。
[0024] 图5是本发明实施例提供的经过药杀后的单克隆细胞连接PCR的结果。
[0025] 图6是本发明实施例提供的经过药杀后的单克隆细胞测序分析结果。
[0026] 图7是本发明实施例提供的经过PCR扩展显示阳性并且细胞测序正确的单克隆细 胞进行Southern杂交的结果图。
[0027] 图8是本发明实施例提供的切除筛选标记基因的示意图。
[0028] 图9是本发明实施例提供的切除筛选标记基因的结果图。
[0029] 图10是本发明实施例提供的诱导性人多能干细胞分化出的屯、肌细胞的巧光照片。
[0030] 图11是本发明实施例提供的CTNT阳性的屯、肌细胞比例(cTNT%)，A为第16-18天筛 选前的屯、肌细胞cTNT%，B为GFP分选后的屯、肌细胞cTNT%，C为化omycin处理后的屯、肌细胞 cTNT%〇
【具体实施方式】
[0031] 可W进行W下操作W实现本发明提供的高效获得屯、肌细胞的方法。
[0032] (1) TALEN设计与组装 选取基因 NKX2.5 (化mo sap iens )的CDS区在1号外显子序列进行BLAST，未发现假基因 序列，在1号外显子设计插入位点。用Golden-Gate法对TALE化进行组装。
[0033] TALEN即转录激活因子样效应物核酸酶，包括识别DNA序列的TALE和切害化NA的核 酸酶部分，是基因修饰中的重要工具之一。TALE蛋白中间为33-35个氨基酸的重复结构组 成，但第12位跟13位氨基酸可变，称为重复单元可变的双氨基酸残基(RVD).TALE单体通过 RVD识别单个核巧酸，对应关系为:NG=T，皿=C，NI=A，NN=G或者A，其中N为天冬酷胺，H为组氨 酸，I为异亮氨酸，D为天冬氨酸，A、T、G、C为四种核巧酸。本具体实施例中针对NKX2.5左臂和 右臂的TALEN RVDs如图一所示。可W看到左臂的TALEN质粒的核巧酸序列是 CGGGCCCAGCGTAGGC，右臂的 TALEN 质粒的核巧酸序列是 CCTCCTGCATGCTGGC。
[0034] TALEN质粒的左臂序列如序列表中SEQ ID NO: 1所示。
[0035] TALEN质粒的右臂序列如序列表中SEQ ID NO:2所示。
[0036] TALEN质粒构建完成之后，需要对其进行测试，W确保TALEN的切割活性W及切割 正确性。
[0037] (2)Single Strand Annealing 测试 SSA，即单链退火检测原理如图2所示，在GFP(绿色巧光蛋白）表达载体中，GFP基因被 TALEN或者CRISPR识别位点分割为两部分；当GFP表达质粒和TALEN或者CRISPR质粒二者共 转入细胞后，被TALEN或者CRISPR切割为线性的GFP表达载体质粒重新形成完整的GFP基因， 其发光强弱代表TALEN或者CRISPR的切割效率。
[003引扩增NKX2.5识别序列并克隆至报告基因质粒，然后将TALEN质粒对与对应的报告 基因质粒转染进入293T细胞，然后WGFP表达的情况反应TALEN的切割活性。巧光亮度越高 说明TALEN切割活性越高。在本具体实施例中，进行Single S化and Annealing测试20小时 和44小时后的巧光效率照片如图3所示，可W看出随着时间增长，293T细胞的GFP巧光表达 越来越强，并且在44小时的时候巧光效率超过了 30%，而作为对照组的单独转染报告质粒的 细