一种通过分步补料提高l-缬氨酸产酸的发酵工艺的制作方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及微生物发酵技术领域，具体涉及一种通过分步补料提高L-缬氨酸产酸的发酵工艺。
【背景技术】
[0002]L-缴氨酸属于分支链氨基酸(branched chain amino acid,BCAA )，是人体必需氨基酸之一，具有多种生理功能，广泛用于医药、食品及调味剂、动物饲料和化妆品的制造。在医药上，L-缬氨酸对肌肉蛋白合成和分解具有极大的耐受性，是制造复合氨基酸输液和氨基酸注射液的原料，近年来已作为氨基酸原料药中用量最大的品种之一，L-缬氨酸是合成一种免疫抗生素的重要中间体，由其合成的缬氨霉素是一种环肽类化合物，被认为是生物体内钾离子穿过生物膜的载体之一，其与钾离子配位可形成C3的对称构象，在生物体的生命活动中扮演着重要角色。在食品上，由其合成的氨基酸埃丝肽可用作美容食品，能有效改善现代女性睡眠不足、解除疲劳、增强食欲，增强皮肤弹性、张力、光泽、柔性，改善皮肤粗糙，增强精力、活力，改善腰疼、肌肉痛、缓和应激等效果。在饲料上，对动物乳腺组织分泌乳汁有重要作用。目前国内外L-缬氨酸生产厂家日渐增多，但是发酵周期长，产酸偏低，副酸多影响提取质量的问题一直是困扰L-缬氨酸规模化生产的主要问题。
【发明内容】
[0003]本发明的目的是为解决上述技术问题的不足，提供一种通过分步补料提高L-缬氨酸产酸的发酵工艺，通过对培养基配方的调整，并同时采取分时段补料工艺及分段控制溶氧的方式，促进了缬氨酸的生物合成，避免了氨基酸生物合成途径中的反馈调节作用，减少了副酸的生成。
[0004]本发明为解决上述技术问题，所提供的技术方案是:一种通过分步补料提高L-缬氨酸产酸的发酵工艺，包括以下步骤:
(I )、培养成熟的菌种:先进行空罐灭菌和实罐灭菌，灭菌结束后降温冷却，然后进行接种，在以下条件下进行培养后得到成熟的菌种:培养温度34-36°(:，？!16.8-7.2，溶氧>25%，压力 0.03-0.08MPa，风量 0.3VVM-2.0VVM ；
(2)、发酵罐培养:先进行空罐灭菌和实罐灭菌，灭菌结束后降温冷却，然后将步骤(I)得到的成熟菌种接种至发酵罐内在以下条件下进行培养以制取L-色氨酸:培养温度34-360C，pH采用补充液氨分段控制，0-18h7.0-7.2，18h_放罐6.4-6.8，溶氧分段控制，0_18hl0_25%，18h-放罐 15-40%，压力0.03-0.08MPa，风量 0.3VVM-2.0VVM，过程中残糖控制0.01-
0.5%，在发酵进行的10-15h，18-24h，28_32h，分别补入培养基玉米浆用量的20%、20%、10%的灭菌玉米浆继续进行发酵。
[0005]作为本发明一种通过分步补料提高L-缴氨酸产酸的发酵工艺的进一步优化:所述步骤(I)中使用的培养基为液体种子培养基，液体种子培养基的成分为:葡萄糖I.4-6.0%、酵母粉0.05-0.3%、(NH4)2HPO4 0.1-0.4%、KC1 0.05-0.3%、MgS04 0.08-0.45%、(NH4)2SO40.06-0.24%、柠檬酸0.08-0.42%、FeSO4 0.00014-0.00042%、MnS04 0.00006-0.00036%、维生素BI 0.000065-0.00039%、生物素0.00001-0.00012%，其余为水。
[0006]作为本发明一种通过分步补料提高L-缴氨酸产酸的发酵工艺的进一步优化:所述步骤(2)中使用的培养基为液体发酵培养基，液体发酵培养基的成分为:葡萄糖1%、酵母粉
0.1%^(NH4)2HPO4 0.12-0.8%^KCL 0.12-0.8%^MgSO4 0.05-0.5%^(NH4)2SO4 0.08-0.48%、柠樣酸0.05-0.5%、FeSO4 0.001-0.l%、Na2S〇4 0.0005-0.006%、MnS04 0.00015-0.0009%、CuSO4 0.00002-0.00018%、CoCl2 0.00014-0.00135%、ZnS04 0.0001-0.0018%，其余为水。
[0007]作为本发明一种通过分步补料提高L-缬氨酸产酸的发酵工艺的进一步优化:所述空罐灭菌的具体操作为:罐体清洗干净，认真检查阀门及人孔后，开蒸汽进行空罐灭菌，灭菌压力为0.11-0.1210^，温度121-123°(:，时间为45-6011^11。
[0008]作为本发明一种通过分步补料提高L-缴氨酸产酸的发酵工艺的进一步优化:所述实罐灭菌的具体操作为:将原料充分溶解后用栗栗入种子培养罐中，开列管升温至80°C后，开蒸汽进入罐内对培养基进行灭菌，灭菌压力为0.11-0.1210^，温度121-123°(:，时间为10-30mino
[0009]作为本发明一种通过分步补料提高L-缴氨酸产酸的发酵工艺的进一步优化:所述步骤(I)中接种的具体操作为:采用压差法进行接种，调PH至6.9，温度35°C，压力0.06MPa，在火焰下旋开接种口防护盖，并迅速将种瓶接种管连接与接种口，缓慢调节压力至0.03MPa，接种结束后，在火焰下拔下接种罐，并迅速将接种口防护盖选在接种口上。
[0010]作为本发明一种通过分步补料提高L-缬氨酸产酸的发酵工艺的进一步优化:所述步骤(2)中接种的具体操作为:调pH至6.9，温度35°C，压力0.06MPa，将种子罐内培养成熟的种子液压入发酵罐内。
[0011]作为本发明一种通过分步补料提高L-缬氨酸产酸的发酵工艺的进一步优化:所述步骤(I)中接种用菌液的制备方法为:取已经菌种生长饱满的茄型瓶，用生理盐水50ml在火焰保护下注入，并用接种环或者玻璃刮刀将表面菌种刮落入生理盐水中，然后将含有菌种的生理盐水在无菌操作下转移到接种瓶内。
[0012]有益效果
申请人针对目前发酵工艺方法中的不足，在天津科技大学、中国氨基酸技术服务中心的帮助指导下，通过对培养基配方的调整，并同时采取分时段补料工艺及分段控制溶氧的方式，促进了缬氨酸的生物合成，避免了氨基酸生物合成途径中的反馈调节作用，减少了副酸的生成。这种分时段的补料方式，不仅满足了菌体在生长过程中对营养的需要，同时解除了高浓度营养成分对菌体生长的抑制作用，提高了原料的利用率，尤其对糖酸转化率的提尚有极大的作用，而溶氧分段控制，对质粒稳定性的提尚及目的基因的尚效表达也有积极的作用。本发明的发酵工艺能使L-缬氨酸产酸由原来的70-80h产酸4.5-5.5%提高到现在的50-55h产酸7.0-8.0%，转化率由原来的20-25%提高到30-32%，并且副酸较少有利于后续提纯。
【具体实施方式】
[0013]下面结合实施例对本发明作进一步的说明:
实施例1 (I)、培养成熟的菌种菌液的制备:
取已经菌种生长饱满的茄型瓶，将生理盐水50ml在火焰保护下注入，并用接种环或者玻璃刮刀将表面菌种刮落入生理盐水中，然后将含有菌种的生理盐水在无菌操作下转移到接种瓶内。
[0014]成熟的种子的培养:
a、空罐灭菌:罐体清洗干净，认真检查阀门及人孔后，开蒸汽进行空罐灭菌，灭菌压力为0.12MPa，温度121°C，时间为45min;
b、实罐灭菌:将按规定含有一定质量分数浓度的原料充分溶解后用栗栗入种子培养罐中，开列管升温至80 0C后，开蒸汽进入罐内对培养基进行灭菌，灭菌压力为0.12MPa，温度121°C，时间为 15min;
c、降温冷却:灭菌结束后，打开列管内冷却水进行降温，降温至36°C，关闭列管冷却水；
d、接种:采用压差法进行接种，调pH6.9，温度32°C，压力0.06MPa，在火焰下旋开接种口防护盖，并迅速将种瓶接种管连接与接种口，缓慢调节压力至0.03 MPa，此时种液在压差下进入罐内，接种结束后，在火焰下拔下接种罐，并迅速将接种口防护盖选在接种口上，火焰灼烧约Imin;
e、培养:培养温度30-32°C，pH通过补充液氨自动控制6.8-7.2，溶氧>25%，压力0.03-0.08MPa，风量 0.3WM-2.0VVM ；
使用的培养基为液体种子培养基，液体种子培养基的成分为:葡萄糖3.0%，玉米楽3.5%，酵母粉0.5%，磷酸二氢钾0.1%，豆浓1.5%，硫酸镁0.04%，维生素BI 0.00003%，生物素0.00002%，其余为水。
[0015](2)、发酵罐培养
b、空罐灭菌:罐体清洗干净，认真检查阀门及人孔后，开蒸汽进行空罐灭菌，灭菌压力为0.12MPa，温度121°C，时间为45min;
b、实罐灭菌:将按规定含有一定质量分数浓度的原料充分溶解后用栗栗入种子培养罐中，开列管升温至80 0C后，开蒸汽进入罐内对培养基进行灭菌，灭菌压力为0.12MPa，温度121°C，时间为 15min;
c、降温冷却:灭菌结束后，打开列管内冷却水进行降温，降温至32°C，关闭列管冷却水；
d、接种:将种子罐内培养成熟的种子液压入发酵罐内；
e、培养:培养温度30-32°C，pH采用补充液氨自动控制7.0-7.2，溶氧分段控制，0-18h20-30%，18h-放罐 10-20%，压力0.03-0.08MPa，风量0.3VVM-2.0VVM，过程中残糖控制
0.01-0.5%。在发酵进行的1h，18h，28h，分别补入底料玉米浆用量的20%、20%、10%的灭菌玉米楽继续进行发酵。
[0016]使用的培养基为液体发酵培养基，液体发酵培养基的成分为:葡萄糖8.0%，玉米浆5.0%，豆浓2.0%，磷酸二氢钾0.18%，硫酸镁0.08%，硫酸钱0.3%，L_蛋氨酸0.05%,L-异亮氨酸0.006%，L-亮氨酸0.02%，维生素BI 0.00002%，生物素0.00001%，其余为水。
[0017]通过该种方式培养，发酵周期:55h，产酸7.2%，转化率31.3%。
[0018]实施例2
(I)、培养成熟的菌种菌液的制备:
取已经菌种生长饱满的茄型瓶，将生理盐水50ml在火焰保护下注入，并用接种环或者玻璃刮刀将表面菌种刮落入生理盐水中，然后将含有菌种的生理盐水在无菌操作下转移到接种瓶内。
[0019]成熟的种子的培养:
c、空罐灭菌:罐体清洗干净，认真检查阀门及人孔后，开蒸汽进行空罐灭菌，灭菌压力为0.12MPa，温度121°C，时间为45min;
b、实罐灭菌:将按规定含有一定质量分数浓度的原料充分溶解后用栗栗入种子培养罐中，开列管升温至80 0C后，开蒸汽进入罐内对培养基进行灭菌，灭菌压力为0.12MPa，温度121°C，时间为 15min;
c、降温冷却:灭菌结束后，打开列管内冷却水进行降温，降温至36